一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法技术

本发明专利技术涉及一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，所述方法通过控制细胞维持液的血清含量为0.5~2%，细胞维持液的换液周期为2~6天，以及，鸡胚成纤维细胞的细胞密度为6~12

【技术实现步骤摘要】
一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法


[0001]本专利技术涉及一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，属于生物


技术介绍

[0002]麻疹是一种由麻疹病毒（measles virus，MV）引起的传染性疾病，主要临床症状是高烧、结膜炎、咳嗽、鼻炎、柯氏斑和全身性斑氏疹。麻疹病毒属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbillivirus），其病毒粒子呈球型，直径约120nm~250nm，包括单股负链RNA和核衣壳（nucleocapsid）结构。其基因组RNA能编码6个结构蛋白，分别是N蛋白、P蛋白、M蛋白、H蛋白、F蛋白和L蛋白。MV只有一个血清型，WHO根据MV的N基因序列将MV分为8个基因组（Geneticgroup），分别为A、B、C、D、E、F、G、H等23个基因型（Genotype）。
[0003]接种麻疹病毒疫苗是控制麻疹的重要手段。然而，在全球麻疹病毒疫苗接种率超过70%的条件下，麻疹并没有被清除。这主要是因为不同基因型麻疹病毒之间的交叉保护不全（尤其是A基因型麻疹病毒疫苗与其他基因型麻疹病毒之间）。当接种者体内某一基因型麻疹病毒疫苗免疫产生的中和抗体的滴度衰减到临界值附近，并且面临其他基因型麻疹病毒的攻击时，就有可能再次患麻疹。因此，针对不同基因型麻疹病毒（尤其是新基因型麻疹病毒）研发麻疹病毒疫苗对麻疹的进一步控制具有重要意义。
[0004]目前，麻疹病毒疫苗均为将麻疹病毒减毒株接种鸡胚成纤维细胞后经培养、收获、冻干制成的麻疹病毒减毒活疫苗，因此，生产不同基因型麻疹病毒疫苗首先要获得不同基因型的麻疹病毒减毒株。对于麻疹病毒这类负链RNA病毒，其自有的RNA聚合酶的纠错能力较弱，很容易产生子代突变体，因此，对麻疹病毒野生株进行减毒的本质就是通过将麻疹病毒野生株接种非最适细胞，在非最佳复制环境下提高自然选择压力，筛选出适应新宿主细胞的突变体，降低对人类细胞的致病力。
[0005]现阶段，麻疹病毒减毒株的制备方法是将麻疹病毒野生株在人原代细胞、动物传代细胞、鸡胚或者鸡胚成纤维细胞（CEF）中经历多轮传代，其传代次数往往达上百代才能成功获得一株稳定的减毒株，耗时较长且成功率低。例如，麻疹病毒减毒株Edmonston（ED）是经人肾细胞传代24代、人羊膜细胞传代28代、鸡胚中传代6代、鸡胚成纤维细胞中传代13代适应得到（参见文献：Katz S L . John F. Enders and measles virus vaccine
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a reminiscence.[J]. Current Topics in Microbiology & Immunology, 2009, 329:3.）；麻疹病毒减毒株S
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191是经人胚肾细胞传代33代、人羊膜细胞传代39代、原代鸡胚细胞中传代15代适应适应得到（参见文献：徐闻青,陈志慧.“沪191”麻疹减毒活疫苗为中国消除麻疹作出贡献[J].上海医药,2010,31(02):59
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61.）。因此，亟需开发一种更加快速并且成功率更高的制备麻疹病毒减毒株的方法。
[0006]研究表明，麻疹病毒野生株在适应鸡胚成纤维细胞的过程中，每代复制过程都会产生大量突变体，并且，麻疹病毒野生株在鸡胚成纤维细胞的适应过程中会大幅降低病毒的致病力，对于毒力致弱至关重要（参见文献：章以浩,吳紹沅,卢宝兰,王子柱,朱既明,张
守德,武文煥,曽国华,肖俊.麻疹病毒減毒过程的观察[J].微生物学报,1966,12(01):15
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23.），同时，将麻疹病毒减毒株接种在鸡胚成纤维细胞中进行培养和收获是使用麻疹病毒减毒株制备麻疹病毒减毒活疫苗的必要环节，因此，麻疹病毒野生株在鸡胚成纤维细胞中的适应性传代十分关键。若能提高麻疹病毒野生株在鸡胚成纤维细胞中进行适应性传代时产生突变体的比例，有望开发更加快速并且成功率更高的制备麻疹病毒减毒株的方法。

技术实现思路

[0007]为解决上述问题，本专利技术提供了一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为6~12
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105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每2~6天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5~2%。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为8~10
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105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每2~4天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5~1%。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为8
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105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每4天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5%。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞生长液中的含量为2~4%。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞培养的温度为36~38℃、时间为12~36h。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述孵育的温度为34~36℃、时间为0.5~2h。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述病毒培养的温度为34~36℃、时间为60~72天。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述病毒为麻疹病毒。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述麻疹病毒为A基因型麻疹病毒、B1‑3基因型麻疹病毒、C1‑2基因型麻疹病毒、D1‑
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基因型麻疹病毒、E基因型麻疹病毒、F基因型麻疹病毒、G1‑3基因型麻疹病毒或H1‑2基因型麻疹病毒。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述鸡胚成纤维细胞为原代鸡胚成纤维细胞。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述原代鸡胚成纤维细胞的制备方法为：将孵化9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种病毒在鸡胚成纤维细胞中的适应方法，其特征在于，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为6~12
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105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每2~6天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5~2%。2.如权利要求1所述的适应方法，其特征在于，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为8~10
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105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每2~4天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5~1%。3.如权利要求2所述的适应方法，其特征在于，所述方法为：将鸡胚成纤维细胞用含胎牛血清的细胞生长液稀释至细胞密度为8
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105个/mL，得到鸡胚成纤维细胞悬液；将鸡胚成纤维细胞悬液添加至培养容器中进行细胞培养，细胞培养结束后，弃去培养容器中上清，将病毒毒株接种至培养容器中进行孵育，孵育结束后，弃去培养容器中上清，在培养容器中加入含胎牛血清的细胞维持液进行病毒培养，使得病毒适应鸡胚成纤维细胞；病毒培养期间，每4天更换一次含胎牛血清的细胞维持液；以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞维持液中的含量为0.5%。4.如权利要求1~3任一项所述的适应方法，其特征在于，以体积百分比计，所述胎牛血清在细胞生长液中的含量为2~4%。5.如权利要求1~3任一项所述的适应方法，其特征在于，所述细胞培养的温度为36~38℃、时间为12~36h。6.如权利要求1~3任一项所述的适应方法，其特征在于，所述孵育的温度为34~36℃、时间为0.5~2h。7.如权利要求1~3任一项所述的适应方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：安祺，田大勇，阮俊程，傅振芳，
申请(专利权)人：北京赛尔富森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：