本发明专利技术公开了人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及应用，属于生物医药技术领域，解决现有技术中分化的重复性差、分化效率低下、分化时间长的问题。本发明专利技术的制备方法包括：步骤1.原条分化；步骤2.前体节中胚层分化；步骤3.传代及巩板间质前体细胞分化。本发明专利技术设计科学，构思巧妙，起始细胞密度控制简单、具体、易实现。本发明专利技术分化流程简单，时间短。本发明专利技术分化而成的细胞表达巩板成骨/软骨间质前体细胞的相关分子标记，且具有体外软骨向及骨向分化能力。采用本发明专利技术方法分化效率高、重复性高。分化效率稳定控制99.2％0
【技术实现步骤摘要】
人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及应用
[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及应用。
技术介绍
[0002]哺乳动物骨骼系统的发育起源于胚胎发育时期三个不同胚层，其中头面部骨及软骨来源于神经嵴间质细胞；除胸骨外的中轴骨(如脊柱、肋骨、肋软骨等)来源于体节中特化的巩板间质细胞；而四肢骨及胸骨则来源于侧板中胚层及其特化产生的肢体芽间质细胞。另一方面，体细胞诱导生成多能干细胞(iPSCs)是生物和医学领域的革命性发现。诱导多能干细胞(iPSCs)不仅能保持自我更新，且具有多向分化潜能，以多能干细胞为材料，通过转基因或化学诱导手段，已经实现了多种人体细胞的体外制备，在适当的诱导条件下可以高效率分化为神经元、心肌细胞以及胰岛素分泌细胞等。
[0003]目前，人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞，皆经由四个不同的胚层谱系逐步诱导而成。例如，Matsuda等首先将人诱导多能干细胞以单细胞状态(8x104个细胞/100mm细胞培养皿)进行接种，扩增4
‑
5天后，通过调控巩板成骨/软骨间质前体细胞形成过程中各胚层分化相关信号通路，经6天时间将人诱导多能干细胞逐步向原条(PS)、前体节中胚层(PSM)、体节(SM)、巩板成骨/软骨间质前体细胞(SCL)诱导，其中除SM至SCL的诱导需72h外，其余胚层诱导时间均为24h。此外，Loh等首先将聚合度为90％的人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞以1:12至1:20传代至培养皿，贴壁/扩增过夜后，通过调控相似通路，同样经6天时间将上述多能干细胞逐步向原条(PS)、前体节中胚层(PSM)、体节(SM)、巩板成骨/软骨间质前体细胞(SCL)诱导，其中除SM至SCL的诱导需72h外，其余胚层诱导时间均为24h。但是，上述两种方法目前皆存在明显的缺陷，包括：
[0004](1)分化的重复性差且分化效率低下。在目前的制备方法中，从多能干细胞接种开始至分化完成，所有流程在同一个培养皿中进行，由此带来的细胞过度扩增问题会引起分化效率低下；同时，不同批次的分化效率会因为密度控制的适宜程度而发生变化。虽然Loh等在其文献中以“1:12至1:20传代至新培养皿，贴壁过夜后进行分化”来描述其对起始细胞密度的控制，但在实际操作过程中这样宽泛的密度范围难以保证各批次分化间的重复性。经测试，以传统方法分化得到的SOX9+巩板间质细胞比例仅在84.9％
±
9.2％(均值
±
标准差，以流式细胞仪分析SOX9阳性细胞比例计)。即在分化细胞中存在超过15％的杂质细胞的污染。
[0005](2)分化时间长。在控制起始细胞密度上，虽然Matsuda等改进了Loh等的方法，将细胞以单细胞形式接种，限制了分化过程中由于细胞密度过高引起的分化效率低下，但是，人多能干细胞在单细胞状态下存活力较差，即使添加了凋亡抑制剂，也不可避免地会造成起始细胞的损失；另外，以其建议的细胞密度以单细胞形式接种后，需经4
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5天的扩增时间才可进行分化，导致制备时间过长，即至少需要10天左右才能完成目标细胞的制备。
[0006]因此，提供一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞，能在短时间制备高纯度该前体细胞，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的之一在于，提供一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法，解决现有技术中分化的重复性差、分化效率低下、分化时间长的问题。
[0008]本专利技术的目的之二在于，提供该方法制得的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞。
[0009]本专利技术的目的之三在于，提供人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的应用。
[0010]本专利技术的目的之四在于，提供包含人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的药物组合物。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0012]本专利技术提供的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞(简称巩板间质前体细胞)的制备方法，包括以下步骤：
[0013]步骤1.原条分化：将分化培养基I加入到人多能干细胞中，诱导培养；所述分化培养基I为含有activin A、CHIR99021、bFGF的CDMi基础培养基；
[0014]步骤2.前体节中胚层分化：将经步骤1培养后的细胞吸去分化培养基I，涮洗细胞后，加入分化培养基II，诱导培养；所述分化培养基II为含有SB431542、LDN193189、CHIR99021、bFGF的CDMi基础培养基；
[0015]步骤3.传代及巩板间质前体细胞分化：将经步骤2培养后的细胞吸去分化培养基II，再消化、中和、吹打细胞，制得单细胞混悬液，离心，重悬，将细胞重悬液接种于培养皿中，加入分化培养基Ⅲ，诱导培养一时间后，再将培养基更换为分化培养基Ⅳ；
[0016]所述分化培养基Ⅲ为含有SAG、LDN193189、XAV939、ROCKi的CDMi基础培养基；
[0017]所述分化培养基Ⅳ为含有SAG、LDN193189、XAV939的CDMi基础培养基。
[0018]本专利技术的部分实施方案中，步骤1中的诱导培养条件为37
±
1℃培养12
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48小时；优选为24小时；
[0019]或/和步骤2中的诱导培养条件为37
±
1℃培养12
‑
48小时；优选为24小时；
[0020]或/和步骤3中采用分化培养基Ⅲ的诱导培养条件为37
±
1℃培养12
‑
48小时；优选为24小时；
[0021]或/和采用分化培养基Ⅳ的诱导培养条件为37
±
1℃培养12
‑
48小时；优选为24小时。
[0022]本专利技术的部分实施方案中，所述分化培养基I中，各组分的含量为activin A 10
‑
40ng/mL、CHIR99021 3
‑
10μM、bFGF 10
‑
30ng/mL；优选为activin A 30ng/mL、CHIR99021 7μM、bFGF 20ng/mL；
[0023]或/和所述分化培养基II中，各组分的含量为：SB431542 10～30μM、LDN193189 100～200nM、CHIR99021 1～6μM、bFGF 20～80ng/mL；优选为SB431542 20μM、LDN193189 125nM、CHIR99021 3μM、bFGF 40ng/mL；
[0024]或/和所述分化培养基Ⅲ中，各组分的含量为：SAG 100～300nM、LDN193189 400～
800nM、XAV939 0.1～0.8μM、ROCKi 5～20μM；优选为SAG 200nM、LDN193189 60本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.原条分化：将分化培养基I加入到人多能干细胞中，诱导培养；所述分化培养基为含有activin A、CHIR99021、bFGF的CDMi基础培养基；步骤2.前体节中胚层分化：将经步骤1培养后的细胞吸去分化培养基I，涮洗细胞后，加入分化培养基II，诱导培养；所述分化培养基II为含有SB431542、LDN193189、CHIR99021、bFGF的CDMi基础培养基；步骤3.传代及巩板间质前体细胞分化：将经步骤2培养后的细胞吸去分化培养基II，再消化、中和、吹打细胞，制得单细胞混悬液，离心，重悬，将细胞重悬液接种于培养皿中，加入分化培养基Ⅲ，诱导培养一时间后，再将培养基更换为分化培养基Ⅳ；所述分化培养基Ⅲ为含有SAG、LDN193189、XAV939、ROCKi的CDMi基础培养基；所述分化培养基Ⅳ为含有SAG、LDN193189、XAV939的CDMi基础培养基。2.根据权利要求1所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法，其特征在于，步骤1中的诱导培养条件为37
±
1℃培养12
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48小时；优选为24小时；或/和步骤2中的诱导培养条件为37
±
1℃培养12
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48小时；优选为24小时；或/和步骤3中采用分化培养基Ⅲ的诱导培养条件为37
±
1℃培养12
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48小时；优选为24小时；或/和采用分化培养基Ⅳ的诱导培养条件为37
±
1℃培养12
‑
48小时；优选为24小时。3.根据权利要求1或2所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法，其特征在于，所述分化培养基I中，各组分的含量为activin A 10
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40ng/mL、CHIR99021 3
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10μM、bFGF 10
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30ng/mL；优选为activin A30ng/mL、CHIR99021 7μM、bFGF 20ng/mL；或/和所述分化培养基II中，各组分的含量为：SB431542 10～30μM、LDN193189 100～200nM、CHIR99021 1～6μM、bFGF 20～80ng/mL；优选为SB431542 20μM、LDN193189 125nM、CHIR99021 3μM、bFGF 40ng/mL；或/和所述分化培养基Ⅲ中，各...
【专利技术属性】
技术研发人员：李中瀚，熊靖飞，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：
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