一种鱼成肌细胞分化培养基及人造鱼肉组织方法技术

本方法通过转录组测序手段，从大量的信号通路中筛选出Notch和TGF

【技术实现步骤摘要】
一种鱼成肌细胞分化培养基及人造鱼肉组织方法


[0001]本专利技术属于食品加工领域，尤其涉及一种鱼成肌细胞分化培养基及人造鱼肉组织方法。

技术介绍

[0002]近年来，基于对效率、可持续性、环境负担和动物福利的担忧，细胞培养肉技术已成为部分替代传统畜牧业肉类生产的替代品。组织样细胞培养肉，其成分和结构与真实肌肉组织相似，主要由脂肪细胞和排列的肌肉细胞组成，已在家禽牛和猪中成功开发。体外三维(3D)细胞培养条件，包括培养基(例如胎牛血清)和支撑材料，在以再生医学和类器官为目的的人类细胞或其他哺乳动物细胞培养物中已有大量研究。但是，食品构建的成本和规模以及其他关键方面(如目标物种、营养素和感官特征)与生物医学组织完全不同。对于细胞培养的肉类，建立自己的方法仍然面临许多难题。
[0003]细胞培养肉的生产是离体细胞(种子细胞)在适宜的培养环境中(培养基)，如温度、氧气、营养物质和生长因子，通过增殖分化形成多核肌管，肌管成熟后形成肌肉纤维，最终成为一种模仿肉的产品。成肌细胞的分化极易受多种调节因子和信号通路影响，发生非预期性细胞命运分化，如细胞凋亡以及纤维样坏死等，导致细胞无法形成肌管，并进一步融合成为肌肉束。但现已知动物基因有上万个，且不同基因与信号通路之间的交互作用异常复杂，从中精准找到调控细胞分化行为的信号通路组合，进而使成肌细胞走向正确的分化命运是极大的挑战。
[0004]细胞支架作为体外细胞三维组织培养中关键的一环，为成肌细胞和脂肪细胞增殖分化提供必要的附着体和载体。细胞培养肉中支架材料的选择既要满足绿色、安全、可食用的生产条件，又要符合细胞生物学特性(支持细胞黏附、增殖、迁移、分化)以及流变转化特性(低于细胞生长温度的凝固点、温和的交联方式、保护细胞的必要黏度)的需求。同时作为食用产品最终的一部分而言，其还要能够具备一定的机械强度，满足消费者对咀嚼性，粘弹性等口感的需求。这是横跨食品、生物、材料、机械等领域的高难度技术挑战。
[0005]海鲜是许多人最喜欢的食物，含有丰富的蛋白质、ω
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3脂肪酸和微量营养素。随着人口的增加，加上环境压力和气候变化，导致近几十年来对海洋食物资源过度开发，这对生态系统产生了巨大影响，因此，创新技术(例如：细胞培养鱼肉)是海鲜生产可持续性的迫切需要。目前虽然在哺乳动物(猪、牛、兔)中有一些类组织化培养肉的研究，但其与天然肉类结构仍有较大差距，多是采用一些简单堆叠的成型方式，其咀嚼性、弹性等尚无法和天然肉类媲美。由于缺乏鱼肌肉组织纹理特性和用于机械支撑的仿真3D支架，生产类组织质构的细胞培养鱼片仍然是一项未完成的任务。

技术实现思路

[0006]一方面，本专利技术通过转录组测序手段，从大量的信号通路中筛选出由Notch和TGF
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β信号通路组合。并发现通过同时抑制Notch和TGF
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β信号通路，能显著提高成肌细胞分化。
[0007]在本专利技术某些优选的实施例中，采用生长因子LY411575和RepSox对上述Notch和TGF
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β信号通路实现抑制。数据表明，LY411575和RepSox的结合，无需借助其他生长因子的辅助，即可实现上述Notch和TGF
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β信号通路的有效抑制，提高成肌细胞分化效率。
[0008]在本专利技术某些优选的实施例中，所述LY411575浓度为1～20nM，RepSox的浓度是1～10μM。
[0009]在本专利技术某些优选的实施例中，所述培养基为F12培养基。F12培养基为细胞分化过程提供能量补充，并协同LY411575和RepSox，促进细胞分化效率，增加肌管融合度。
[0010]作为本专利技术的另一方面，本专利技术提供一种成肌细胞的三维培养方法，该方法将成肌细胞和支架前驱体组成生物墨水，进行3D仿真打印，固化后采用上述培养基进行培养，得到三维肌肉组织。在三维体系下，成肌细胞在明胶基支架中三维生长，上述抑制Notch和TGF
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β信号通路的培养基促进了鱼成肌细胞的肌源性分化，在3D体系下发挥了它独到的优势。通过实验证明，同样的培养基在三维体系下相比于二维体系，其分化促进率提高了9.79％。
[0011]在本专利技术某些优选的实施例中，所述支架前驱体包括明胶，且生物墨水中明胶的浓度在5～10％。明胶可以为细胞黏附提供生物位点，增加细胞活性并为其生长提供生存空间。
[0012]在本专利技术某些优选的实施例中，所述生物墨水中，细胞浓度是1
×
106～1
×
107。
[0013]在本专利技术某些优选的实施例中，所述生物墨水中，还具有固化剂用于使明胶成型；固化后的明胶的硬度在9～14kPa。适宜的支架硬度有助于促进细胞贴壁，增加细胞活性并为其分化提供承载力。
[0014]在本专利技术某些优选的实施例中，所述的固化剂是海藻酸钠、壳聚糖，固化剂的固化通过固化引发剂实现，所述固化引发剂包括氯化钙、氯化钙、柠檬酸钠、氯化镁和氯化锌等。
[0015]在本专利技术某些优选的实施例中，固化的浓度为0.1～5％,固化时间为1～10min。
[0016]在本专利技术某些优选的实施例中，培养的条件为27℃，二氧化碳浓度5％。
[0017]在本专利技术某些优选的实施例中，3D仿真打印是基于鱼肌组织模型进行打印，得到具有鱼肌组织结构的三维肌肉组织。具体的来说，对软组织进行染色，然后通过micro
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CT扫描获取真实肉品二维切片图像，从而生成三维模型。
[0018]最后，本专利技术还涉及一种人造鱼肉组织成型方法，将鱼肉脂肪细胞填充至前述培养得到的肌肉组织中。相比于现有的堆叠方法，本方法更加简便，效率高，硬度、粘性、弹性、弹性等与天然鱼肌肉组织更加相似。
[0019]本专利技术的有益效果在于：
[0020](1)使用本专利技术中包含LY411575和RepSox的培养基，鱼成肌细胞二维分化效率从1％提高至32％，为后续肌肉组织的形成创造了良好的基础；
[0021](2)本专利技术中的明胶基细胞支架，对鱼细胞生物相容性优良，支持鱼细胞贴壁、增殖、分化，与本研究中包含LY411575和RepSox的分化培养基组合使用使鱼成肌细胞分化效率达到41.79％；
[0022](3)本专利技术人造鱼肉组织方法，能得到硬度、粘性、弹性、弹性等与天然鱼肉相似的细胞培养肉制品。
附图说明
[0023]图1a为肌源性分化过程中的明场和免疫荧光图像(上为明场图，下为Dsemin染色后荧光显微镜观察图)，b为肌源性分化过程中肌融合指数图(0天，3天，6天)；
[0024]图2a为显示了第0天、第3天和第6天肌源分化期间所有差异表达基因的热图，b为显示了第0天和第3天之间差异表达基因的火山图,c为与第0天相比，第3天上调(红色条)和下调(蓝色条)的前10个富集Go分析，d为与肌肉形成相关的基因表达模式的热图，e为细胞周期相关基因的热图,f为Notch相关基因表达的热图,g为T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鱼成肌细胞分化培养基，其特征在于，所述培养基同时抑制Notch和TGF
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β信号通路。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的生长因子为LY411575和RepSox。3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述LY411575浓度为1～20nM，RepSox的浓度是1～10μM；所述培养基为F12培养基。4.一种鱼成肌细胞的三维培养方法，其特征在于，将鱼成肌细胞和支架前驱体组成的生物墨水，进行3D仿真打印，固化后采用权利要求1～4任一项所述的培养基进行培养，得到三维肌肉组织。5.根据权利要求4所述的三维培养方法，其特征在于，所述支架前驱体包括明胶，且生物墨水中明胶的浓度在5～10％。6.根据权利要求4所述的三维...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘东红，陈军，徐恩波，黄晓，陈启和，尹俊，牛瑞浩，劳霁晖，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：