一种用于构建AAV血清型随机插入的突变库及其试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于构建AAV血清型随机插入的突变库及其试剂盒和方法。所述突变库是通过AAV血清型随机插入构建的。所述试剂盒包括：Cap克隆载体、含有筛选基因的转座子、转座酶、去除筛选基因的特异性核酸内切酶以及含AAV Rep编码基因序列和两端ITR编码基因序列的载体。本发明专利技术解决了现有技术中新AAV血清型获得效率低、靶向性低的问题，建立了一种操作相对简单、成功率高、且时间周期较短的随机插入突变方法，具有重要的意义。义。

【技术实现步骤摘要】
一种用于构建AAV血清型随机插入的突变库及其试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种用于构建AAV血清型随机插入突变库的试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]AAV是DNA小病毒，由长度为4.7kb的单链DNA基因组构成。天然存在的AAV病毒基因组的两端的ITR之间含有衣壳蛋白rep基因和复制相关蛋白Cap基因的开放阅读框。改造后的AAV表达载体切除了Rep和Cap基因序列，以插入其他目的基因表达框，并与编码Rep/Cap基因的包装质粒共转染含有E1基因的HEK
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293T后，即可包装并释放出具有侵染力(含DNA和衣壳)的病毒粒子。
[0003]由于AAV病毒是细小病毒，可以作为有效的外源DNA递送载体的重组腺相关病毒(rAAV)的表达载体，除了指导基因组的复制和病毒载体组装的作用的ITR序列外，两端ITR之间编码病毒蛋白的序列完全被删除，取而代之的是外源的转基因(transgene)序列。将编码病毒蛋白的基因删除除可以减小体内递送转基因时产生的免疫原性和细胞毒性外，最大的优点就是可以最大化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变库，所述突变库是通过AAV血清型随机插入构建的。2.一种构建AAV血清型随机插入突变库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)在转座酶的作用下，将含有筛选基因的转座子随机插入Cap克隆载体，获得突变反应产物混合物；(2)扩增并筛选出插入了转座子的突变反应产物，获得混合克隆质粒；(3)将步骤(2)获得的混合克隆质粒抽提出来；(4)将步骤(3)抽提出的混合克隆质粒进行酶切，回收因插入了转座子而引入突变的Cap编码基因片段和空白克隆载体片段，进行连接反应，获得仅Cap编码基因突变的Cap克隆载体混合物，记为Cap插入突变混合质粒；(5)将Cap插入突变混合质粒去除筛选基因，获得突变的Cap克隆载体库；(6)将突变的Cap克隆载体库酶切，回收被突变后的Cap编码基因序列，插入至含AAVRep编码基因序列和两端ITR编码基因序列的载体，获得目的质粒插入突变库；(7)将目的质粒插入突变库与辅助载体一起转染细胞，获得AAV突变病毒库。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转座子选自转座噬菌体或TnA家族。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述转座子选自MuA转座子、Tn5转座子、Tn7转座子或Tn10转座子。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转座子中的筛选基因为抗药性基因；优选的，所述转座子中的筛选基因为原核抗生素基因。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Cap克隆载体是指携带有Cap编码基因序列的克隆载体，通过将Cap编码基因序列插入克隆载体后获得。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述克隆载体选自PMD19T质粒、PMD18T质粒、pUC19质粒或pUC57质粒。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中去除筛选基因通过用特异性限制内切酶切除筛选基因。9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，含AAV Rep编码基因序列和两端ITR编码基因序列的载体，是将Rep编码基因序列和两端ITR编码基因序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩芳婷，曾立，崔先同，王庆亮，詹霞，
申请(专利权)人：上海吉凯基因医学科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：