一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法，涉及生物技术领域。该腺病毒包括：密码子优化后的G

【技术实现步骤摘要】
一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法。

技术介绍

[0002]狂犬病是人类和动物的一种共患但可预防的严重传染性疾病，可于恒温动物身上造成严重脑炎。没有接受疫苗免疫的感染者，当神经症状出现后几乎必然死亡，通常的死亡原因都是由于中枢神经(脑
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脊髓)被病毒破坏。病毒大量存在于发病者的脑脊液、唾液和体液中，绝大部分通过咬伤传播。据统计，狂犬病每年在全世界造成26,000
‑
55,000人死亡，其中，超过95％的死亡病例发生在亚洲与非洲，而死亡病例中绝大多数(97％)由狗引起。
[0003]狂犬病毒进入人体，沿周围传入神经而到达中枢神经系统，因此头、颈部、上肢等处咬伤和创口面积大而深者发病机会多。狂犬病毒主要存在于患病动物的延脑、大脑皮层、小脑和脊髓中。唾液腺和唾液中也常含有大量病毒，人被患狂犬病的动物咬伤、抓伤或经粘膜感染均可引起狂犬病，在特定条件下也可以通过呼吸道气溶胶传染。
[0004]临床上狂犬病是一种急性、进行性脑炎，通常分为躁狂或麻痹性脑炎。感染者发病时呈高度兴奋状态，并伴有发热、头痛、恐怖不安、惊风怕声、肢休发麻、吞咽困难，一旦喝水即引起严重痉挛等症状，出現恐水现象，故又称「恐水症」(hydrophobia)。3
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5日后，病人转入麻痹、昏迷状态，最后呼吸、循环衰竭而死。
[0005]狂犬病的病原体是狂犬病病毒(Rabies virus)，狂犬病毒(Rabies virus,RV)属于弹状病毒科，弹状病毒属，是引起狂犬病的病原体。外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。病毒颗粒外有囊膜，内有核蛋白壳。狂犬病病毒是一种包膜RNA病毒，其包含五种结构蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA聚合酶。其中，糖蛋白(G)被认为是诱导病毒中和抗体的保护性抗原。
[0006]狂犬病病毒基因组由11928或11932个核苷酸组成的单股负链不分节段的RNA，基因组从3
′
端至5
′
端的排列依次为N、P、M、G和L基因，分别编码5种结构蛋白，其阅读框大小依次为1353、894、609、1575、6429nt。
[0007]狂犬病病毒存在于世界大部分地区，但狂犬病病毒主要宿主的物种因地理区域而异，包括野狗、浣熊、臭鼬、狐狸、蝙蝠和雪貂等。狂犬病病毒最常见的传播方式是受感染动物的叮咬。一旦狂犬病病毒感染中枢神经系统，狂犬病的临床症状就会显现出来。
[0008]目前，针对狂犬病并无特效药，预防是关键。如果出现被猫狗等动物抓伤、咬伤，应及时接种疫苗。目前的狂犬疫苗大部分是灭活疫苗，也有部分重组疫苗及病毒载体疫苗进入临床及上市。如ONRAB，表达狂犬病的糖蛋白，用于狐狸、浣熊和臭鼬的口服免疫。
[0009]目前，尚无报道利用黑猩猩腺病毒开发出来的表达狂犬病毒G蛋白的狂犬病毒疫苗。
[0010]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的在于提供一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒及其制备方法以解决上述技术问题。
[0012]腺病毒(Ads)已被作为载体以表达外来抗原。Ad基因组可以通过将基因插入删除的早期(E)3域，该域包含对病毒生长无关的基因。或者可以将表达盒放入已删除的E1域中，而由E1编码的基因对于复制至关重要，它们的删除使矢量复制有缺陷。可以使用包装连接序列以转补删除的E1基因，从而允许E1删除的载体的有效生长。
[0013]腺病毒(Ads)是常见的物种特异性病原体，从人类到青蛙等不同类型的动物中都可以分离出来。大多数人类在很小的时候就感染了腺病毒(Ads)，并开发出特定于腺病毒(Ad)疫苗，从而抑制了对同一病毒的感染。因此，基于普通人类血清型的Ad疫苗的免疫反应通常因其预存的中和抗体而减弱，使用基于从黑猩猩等其他物种分离的腺病毒的疫苗则可以规避这一点，而且腺病毒载体疫苗具有滴度高，载量大，使用方便的特点。
[0014]虽然黑猩猩腺病毒(AdC)在人类腺病毒中按系统发育分组并具有许多共同的特点，但它们既不在人类中流通，根据已有的研究也没有表现出抗体对人类血清型腺病毒的交叉中和。基于此，本专利技术提出了一种以黑猩猩腺病毒为载体的狂犬疫苗。
[0015]本专利技术是这样实现的：
[0016]本专利技术提供了一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒，其包括：密码子优化后的Gp基因、WPRE转录后调控元件以及包含KE、AK、XA和PX片段的AdC68基因组序列，AdC68基因组中第594
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3513位之间插入连接序列以替换第594
‑
3513位之间E1的大部分序列。
[0017]专利技术人发现，通过对Gp基因的密码子进行优化，并插入WPRE转录后调控元件，实现了狂犬病毒G蛋白的高水平分泌表达。得到的狂犬病毒G蛋白的结构和功能与天然状态完全一致，最大程度上保留了G蛋白的免疫原性，可以更好地被抗原呈递细胞识别。
[0018]专利技术人通过密码子优化，使得Gp基因更适合在293细胞中表达。编码同一氨基酸的密码子被称为同义密码子，生物体自然状态下编码同一氨基酸时使用同义密码子的频率是不同的，有的密码子很少使用，被称为稀有密码子，有的却使用非常频繁，且具有明显的物种特异性，表明同义密码子的使用具有偏好性。为了提高转基因的表达率，可根据密码子偏好性理论对目的基因进行优化，例如将低频使用的密码子替换为高频率密码子。
[0019]WPRE元件可增加病毒表达量，提高病毒滴度。
[0020]可以用于制备相应的狂犬疫苗，基于重组黑猩猩腺病毒特有的免疫原性，由其制备的狂犬疫苗也具有高度的免疫原性、低预存抗体性和安全性，能有效激活机体的免疫反应，刺激被免疫对象产生高水平的特异性中和抗体，对狂犬病毒发挥高效、优异的免疫保护效果。
[0021]通过在载体上插入连接序列以转补删除的E1基因，从而保证了E1删除后的病毒能正常扩增。
[0022]专利技术人发现，特定地在AdC68基因组中第594
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3513位之间插入连接序列，用于替换第594
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3513位之间E1的大部分序列，可以最大限定地保留黑猩猩源腺病毒的原始序列。
[0023]在本专利技术应用较佳的实施方式中，密码子优化后的Gp基因如SEQ ID NO.1所示，连接序列如SEQ ID NO.2所示。
[0024]针对腺病毒AdC68基因组，本专利技术人经过细致的序列比对，最终确定了应用酶切位点SceI和CeuI作为狂犬病毒G蛋白编码基因的插入位点，从而不会导致在腺病毒表达载体的其它位置造成剪切。
[0025]由于腺病毒的基因组比较大，大约有36kb，直接克隆重组腺病毒载体具有较大的技术瓶颈。因此，本专利技术人开发了能通过酶切连接本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达狂犬病毒G蛋白的重组黑猩猩源腺病毒，其特征在于，其包括：KE、AK、XA和PX片段的AdC68基因组序列，AdC68基因组中第594
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3513位之间插入连接序列以替换第594
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3513位之间E1的部分序列，所述PX片段包含密码子优化后的Gp基因、WPRE转录后调控元件。2.根据权利要求1所述的重组黑猩猩源腺病毒，其特征在于，所述密码子优化后的Gp基因如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的重组黑猩猩源腺病毒，其特征在于，所述连接序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的重组黑猩猩源腺病毒，其特征在于，所述重组黑猩猩源腺病毒的KE、AK、XA和PX片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3
‑
6所示。5.一种如权利要求1
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4任一项所述的重组黑猩猩源腺病毒的制备方法，其特征在于，其包括：将密码子优化后的Gp基因、WPRE转录后调控元件与包含连接序列、KE、AK、XA...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨军，邓飞，郑飞，刘璐，
申请(专利权)人：长睿生物技术成都有限公司，
类型：发明
国别省市：