一种重组3型鸭腺病毒、制备方法及其应用技术

本发明专利技术提出了一种重组3型鸭腺病毒、制备方法及其应用，涉及分子生物学技术领域。该重组3型鸭腺病毒分别能表达鸭病毒性肝炎病毒VP1基因和番鸭细小病毒VP3基因，VP1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，VP3基因的序列如SEQ ID NO.2所示，其能够主要解决现目前3型鸭腺病毒疫苗的应用范围较窄的技术问题，另外，本发明专利技术还提供了一种重组3型鸭腺病毒的制备方法，该方法不仅操作简单，且耗时短、精确性高。精确性高。精确性高。

【技术实现步骤摘要】
一种重组3型鸭腺病毒、制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体而言，涉及一种重组3型鸭腺病毒、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]疫苗接种是控制人类与动物传染病的一种极为有效的手段。传统的灭活疫苗和弱毒疫苗具有诸多局限性，已经难以满足当前相关产业发展的要求。随着DNA重组技术的出现和快速发展，基因工程疫苗在动物传染病防治中得到了广泛的研究和应用。重组病毒载体疫苗是一种将外源保护性抗原基因插入到病毒基因组内并和病毒一起表达，从而诱导机体免疫应答的基因工程疫苗，具有插入外源基因长、接种途径多、易生产等优点，能克服传统疫苗的某些弊端，提高疾病防治效果。
[0003]近几年，3型鸭腺病毒呈爆发趋势，其引起病鸭肝脏黄化、肿大、出血，形成大小不等的坏死灶，导致病鸭死亡。该病在广东、福建、安徽、浙江等地流行，严重危害养禽业发展。腺病毒作为载体应用于疫苗研究有诸多优点：感染范围广、接种方式多，外源基因承载量大、安全性高，复制滴度高等，已在哺乳动物兽用疫苗领域得到了广泛深入的研究。3型鸭腺病毒作为腺病毒也具有上述特点，拥有成为禽用疫苗载体的潜力，然后现目前的3型鸭腺病毒疫苗的应用领域较窄，只能单一防治3型鸭腺病毒，无法防治由3型鸭腺病毒引起的其他病症等。

技术实现思路

[0004]本专利技术的第一目的在于提供一种重组3型鸭腺病毒，其能够主要解决现目前3型鸭腺病毒疫苗的应用范围较窄的技术问题。
[0005]本专利技术的第二目的在于提供一种重组3型鸭腺病毒的制备方法，该方法不仅操作简单，且耗时短、精确性高。
[0006]本专利技术的第三目的在于提供一种重组3型鸭腺病毒在制备3型鸭腺病毒疫苗中的应用。
[0007]本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
[0008]一方面，本专利技术提供了一种重组3型鸭腺病毒，包括目的基因和3型鸭腺病毒毒株，目的基因包括鸭病毒性肝炎病毒VP1基因，VP1基因的序列如SEQ ID NO.1所示。通过向3型鸭腺病毒毒株中导入所需目的基因，使在制备疫苗过程中不仅能作为3型鸭腺病毒疫苗的抗原，也可以作为与目的基因有关的抗原，从而提升疫苗的适用范围。鸭病毒性肝炎是一种传播迅速和高度致死性传染病，主要特征为肝脏肿大，有出血斑点和神经症状，本病的死亡率很高，可达90％以上。通过构建表达鸭病毒性肝炎病毒VP1基因的重组3型鸭腺病毒能够作为制备鸭病毒性肝炎疫苗的原材料，从而在保证防治3型鸭腺病毒的同时，还能够防治鸭病毒性肝炎，以提升3型鸭腺病毒疫苗的适用范围和领域。
[0009]第二方面，本专利技术还提供了一种重组3型鸭腺病毒的制备方法，包括如下步骤，取3
型鸭腺病毒毒株与受体载体连接，得到感染性克隆质粒，然后通过Red/ET重组技术，在感染性克隆质粒的插入位点引入筛选基因，再使用插入的目的基因替换筛选基因，得到含有目的基因和3型鸭腺病毒毒株的重组质粒，进而拯救获得重组3型鸭腺病毒。该制备方法是以3型鸭腺病毒CH
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GD
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12
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2014株感染性克隆的病毒载体为基础，利用Red/ET重组技术和ccdB反向筛选技术通过两步同源重组得到含有目的基因的重组病毒。本方法安全可靠，并可实现稳定表达，且该方法操作简单方便，能够准确转染，提高重组成功率。
[0010]第三方面，本专利技术还提供了一种重组3型鸭腺病毒在制备3型鸭腺病毒疫苗中的应用。
[0011]相对于现有技术，本专利技术至少具有如下优点或有益效果：
[0012]一、本专利技术提供了一种重组3型鸭腺病毒，通过构建表达鸭病毒性肝炎病毒VP1基因的重组3型鸭腺病毒能够作为制备鸭病毒性肝炎疫苗的原材料，从而在保证防治3型鸭腺病毒的同时，还能够防治鸭病毒性肝炎，从而提升3型鸭腺病毒疫苗的适用范围和领域。
[0013]二、本专利技术还提供了一种重组3型鸭腺病毒的制备方法，该制备方法是以3型鸭腺病毒CH
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GD
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12
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2014株感染性克隆的病毒载体为基础，利用Red/ET重组技术和ccdB反向筛选技术通过两步同源重组得到含有目的基因的重组病毒。本方法安全可靠，并可实现稳定表达，且该方法操作简单方便，能够准确转染，提高重组成功率。
附图说明
[0014]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0015]图1为PCR扩增制备含有同源臂的筛选标记基因表达盒，其中1：CMV
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Cm
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ccdB
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SV40pA；2：空白对照；M：DNA Marker DL5,000；
[0016]图2为重组质粒p15A
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DAdV3
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CMV
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Cm
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ccdB
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SV40pA经ApaLI酶切鉴定，其中1：p15A
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DAdV3
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CMV
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Cm
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ccdB
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SV40pA酶切SnapGene软件预测；2：p15A
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DAdV3
‑
CMV
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Cm
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ccdB
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SV40pA酶切；M：NEB 1KB DNA Ladder；
[0017]图3为PCR扩增制备含有同源臂的DHAV
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VP1基因，其中1：DHAV
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VP1；2：空白对照；M：DNA Marker DL1000；
[0018]图4为重组质粒p15A
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DAdV3
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CMV
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DHAV
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VP1
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SV40pA经ApaLI酶切鉴定，其中1：p15A
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DAdV3
‑
CMV
‑
DHAV
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VP1
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SV40pA酶切SnapGene软件预测；p15A
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DAdV3
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CMV
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DHAV
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VP1
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SV40pA酶切；M：NEB 1KB DNA Ladder；
[0019]图5为PCR扩增rDAdV3
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DHAV
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VP1 F5；其中1：DAdV3
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JC；2：DHAV
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JC
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VP1；M：DNA Marker DL1000；
[0020]图6为WB检测rDAdV3
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组3型鸭腺病毒，其特征在于，包括目的基因和3型鸭腺病毒毒株，所述目的基因包括鸭病毒性肝炎VP1基因，所述VP1基因的序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的重组3型鸭腺病毒，其特征在于，所述目的基因还包括番鸭细小病毒VP3基因，所述VP3基因的序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种如权利要求1或2所述的重组3型鸭腺病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取所述3型鸭腺病毒毒株与受体载体连接，得到感染性克隆质粒，然后通过Red/ET重组技术，在所述感染性克隆质粒的插入位点引入筛选基因，再使用插入的所述目的基因替换筛选基因，得到含有所述目的基因和所述3型鸭腺病毒毒株的重组质粒，进而拯救获得重组3型鸭腺病毒。4.根据权利要求3所述的重组3型鸭腺病毒的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：以质粒pBR322
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Cm
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ccdB为模板，扩增含有同源臂的CMV
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Cm
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ccdB
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SV40pA双向筛选基因表达盒；将所述感染性克隆质粒与所述双向筛选基因表达盒共同转入第一感受态菌体细胞内，得到第一重组质粒，将所述目的基因的扩增产物与所述第一重组质粒共同转入第二感受态菌体细胞内，得到第二重组质粒；将所述第二重组质粒酶切去除所述受体载体后回收并转染DEF细胞，得到悬液，将所述悬液冻融、离心后取上清液，即得到所述重组3型鸭腺病毒。5.根据权利要求3所述的重组3型鸭腺病毒的制备方法，其特征在于，所述受体载体为p15A，所述3型鸭腺病毒毒株为CH
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GD
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12
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2014。6.根据权利要求5所述的重组3型鸭腺病毒的制备方法，其特征在于，所述双向筛选基因表达盒的插入位点为所述3型鸭腺病毒毒株CH
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【专利技术属性】
技术研发人员：谢青梅，符军，何家辉，刘仙琦，封柯宇，邵冠明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：