一种利用亲和层析介质富集抗体的方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种利用亲和层析介质富集抗体的方法及其应用，所述方法包括：(1)将抗原和GST通过戊二醛交联形成抗原

【技术实现步骤摘要】
一种利用亲和层析介质富集抗体的方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种利用亲和层析介质富集抗体的方法及其应用。

技术介绍

[0002]目前，大部分基础实验的研究需要特异性强以及效价高的抗体，例如在免疫酶联吸附试验中，需要利用抗体检测生物样品中目的蛋白的含量，特异性强、效价高的抗体可以减少背景信号，能够灵敏准确地检测蛋白的含量。
[0003]目前抗体的开发路线包括：使用抗原免疫动物，取免疫后的动物血清进行富集纯化得到多克隆抗体，或者选择从免疫的动物体内提取免疫细胞融合成杂交瘤细胞，利用杂交瘤细胞分泌抗体，再进行分离纯化得到单克隆抗体。虽然大部分单克隆抗体具有特异性强、效价高的优点，能适用于基础实验的研究，但是其开发周期长、成本高。
[0004]多克隆抗体一般选择protein A/G纯化柱进行分离纯化，利用protein A/G与免疫球蛋白(IgG)的Fc(片段可结晶)区域具有高结合亲和力的原理，将protein A或者protein G连接到固体支持基质上，能有效地从血清中分离IgG，Protein A/G柱可以将所需的抗体的浓度富集超过100倍。
[0005]CN110567787A公开了一种快速纯化血清中IgG和IgE的方法，所述方法包括构建串联亲和纯化系统，将Protein G琼脂糖凝胶与血清混合孵育，得到结合成分A和流穿成分B，将流穿成分B与Protein L琼脂糖凝胶孵育，得到结合成分C和流穿成分D，利用甘氨酸缓冲液分别洗脱所述结合成分A和所述结合成分C，分别得到纯化后的IgG溶液和IgE溶液，所述方法能够在1h内从少量血清样品中分别纯化得到IgG和IgE。
[0006]但是，所述方法无法针对性地富集IgG，其中与抗原特异性结合的IgG在总IgG中占比很小，限制了多克隆抗体的效价，增加了实验过程中的空白信号和背景信号。
[0007]为了更好地富集目标抗体，利用抗体抗原结合的特异性，将抗原与含有NHS
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基团的固体基质以共价键方式连接，装入色谱柱，可以从血清或者多克隆抗体中选择性捕获抗原特异性抗体。所述方法可以达到富集和纯化目标抗体的作用，但是其成本高昂，NHS键易水解，难以标记小肽。除此之外，将抗原直接共价连接在固体基质上，增加了抗原与抗体结合的位阻效应，影响富集的效率。因此，开发一种新型、高效的富集目标抗体的方法具有重要意义。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种利用亲和层析介质富集抗体的方法及其应用。所述方法利用少量抗原就可以完成抗体的富集，利用抗原抗体结合原理，选择性捕获特异性抗体，富集效率高，能极大地提高抗体的效价。本专利技术中所述的利用亲和层析介质富集抗体的方法富集效率高，抗原与固体基质直接通过GST和GSH连接，减少抗体抗原结合中的位阻效应，有利于目标抗体与抗原的特异性结合。本专利技术所述的方法尤其适用于小肽抗体的富集(本
专利技术中的小肽抗体是指抗原为小肽，得到的相应抗体为小肽抗体)，戊二醛交联小肽以及GST的效率极高。
[0009]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种利用亲和层析介质富集抗体的方法，所述方法包括：
[0011](1)将抗原和GST通过戊二醛交联形成抗原
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GST复合物；
[0012](2)将所述抗原
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GST复合物与GST
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标签纯化树脂连接，得到所述亲和层析介质；
[0013](3)利用所述亲和层析介质富集抗体。
[0014]优选地，步骤(1)中，所述抗原和GST通过戊二醛交联形成抗原
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GST复合物的步骤包括：
[0015]a.向抗原溶液中加入戊二醛并混合，孵育，去除多余的戊二醛；
[0016]b.将戊二醛处理后的抗原与GST溶液混合，孵育，向孵育后的溶液中加入硼氢化钠，还原。
[0017]在本专利技术中，利用戊二醛交联法将目的抗原与GST共价交联，戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与抗原和GST的氨基结合。先将戊二醛与抗原结合，形成戊二醛
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抗原复合物，结合层析或者透析去除未结合的戊二醛，然后再将戊二醛
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抗原复合物与GST结合，形成抗原
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GST复合物。也可以通过戊二醛一步交联法将抗原和GST交联成抗原
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GST复合物，直接将抗原与GST同时加入戊二醛溶液中，戊二醛的两个醛基分别于GST和抗原上的氨基反应，生成席夫碱。
[0018]优选地，步骤a中，所述抗原溶液为含有抗原的磷酸盐缓冲液，所述抗原溶液的pH为6.8～7.4，例如可以是6.8、6.85、6.9、6.95、7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35或7.4等。
[0019]优选地，步骤a中，所述抗原溶液中抗原的质量浓度为0.1～10mg/mL，例如可以是0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL或10mg/mL等。
[0020]优选地，步骤a中，所述戊二醛与抗原溶液的体积比为(1.25～2.5):100，例如可以是1.25:100、1.5:100、1.75:100、2.0:100、2.25:100或2.5:100等。
[0021]在本专利技术中，戊二醛作为交联剂，添加量过多，容易造成溶液中的抗原自连，抗原溶液形成沉淀，影响后续与GST的交联；添加量过少，交联效果弱。
[0022]优选地，步骤a中，所述孵育的时间为8～12h，例如可以是8h、9h、10h、11h或12h等；所述孵育的温度为20～25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。
[0023]优选地，步骤a中，所述去除多余的戊二醛采用G
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25脱盐柱或分子筛进行。
[0024]优选地，步骤b中，所述GST溶液为含GST的碳酸钠溶液，所述GST溶液的pH为9.0～9.5，例如可以是9.0、9.1、9.2、9.3、9.4或9.5等。
[0025]优选地，步骤b中，所述GST溶液中GST的质量浓度为0.1～10mg/mL，例如可以是0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL或10mg/mL等。
[0026]优选地，步骤b中，所述抗原与GST的摩尔比为(1～5):1，例如可以是1:1、2:1、3:1、4:1或5:1等。
[0027]优选地，步骤b中，所述孵育的温度为0～4℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃或4℃等，优选为4℃，所述孵育的时间为8～12h，例如可以是8h、9h、10h、11h或12h等。
[0028]优选地，步骤b中，所述硼氢化钠在溶液中的终浓度为9～10mg/mL，例如可以是
9mg/mL、9.3mg/mL、9本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用亲和层析介质富集抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)将抗原和GST通过戊二醛交联形成抗原
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GST复合物；(2)将所述抗原
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GST复合物与GST
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标签纯化树脂连接，得到所述亲和层析介质；(3)利用所述亲和层析介质富集抗体。2.根据权利要求1所述的利用亲和层析介质富集抗体的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述抗原和GST通过戊二醛交联形成抗原
‑
GST复合物的步骤包括：a.向抗原溶液中加入戊二醛并混合，孵育，去除多余的戊二醛；b.将戊二醛处理后的抗原与GST溶液混合，孵育，向孵育后的溶液中加入硼氢化钠，还原。3.根据权利要求2所述的利用亲和层析介质富集抗体的方法，其特征在于，步骤a中，所述抗原溶液为含有抗原的磷酸盐缓冲液，所述抗原溶液的pH为6.8～7.4；优选地，步骤a中，所述抗原溶液中抗原的质量浓度为0.1～10mg/mL；优选地，步骤a中，所述戊二醛与抗原溶液的体积比为(1.25～2.5):100；优选地，步骤a中，所述孵育的时间为8～12h，所述孵育的温度为20～25℃；优选地，步骤a中，所述去除多余的戊二醛采用G
‑
25脱盐柱或分子筛进行；优选地，步骤b中，所述GST溶液为含GST的碳酸钠溶液，所述GST溶液的pH为9.0～9.5；优选地，步骤b中，所述GST溶液中GST的质量浓度为0.1～10mg/mL；优选地，步骤b中，所述抗原与GST的摩尔比为(1～5):1；优选地，步骤b中，所述孵育的温度为0～4℃，所述孵育的时间为8～12h；优选地，步骤b中，所述硼氢化钠在溶液中的终浓度为9～10mg/mL；优选地，步骤b中，所述还原的温度为0～4℃，所述还原的时间为0.8～1.2h。4.根据权利要求1～3中任一项所述的利用亲和层析介质富集抗体的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述抗原
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GST复合物的制备步骤还包括分离抗原
‑
GST复合物；优选地，所述分离采用分子筛进行。5.根据权利要求1～4中任一项所述的利用亲和层析介质富集抗体的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈平，洪伟，陈爽，祝茜茜，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：