一种复发肺癌穿刺样本类器官培养基及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种复发性肺癌穿刺样本类器官的培养基及其培养方法。通过调整培养基各组分的含量，能够实现对复发性肺癌穿刺样本的类器官培养，大大提高了肺癌类器官培养成功率，缩短培养周期，为揭示复发性肺癌发病机理和筛选抗癌药物奠定了基础。和筛选抗癌药物奠定了基础。和筛选抗癌药物奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种复发肺癌穿刺样本类器官培养基及其应用


[0001]本专利技术涉及细胞培养领域，具体的涉及一种复发性肺癌类器官的培养基及其培养方法。

技术介绍

[0002]肺癌居全球范围内癌症发病和死因之首，每年全球有180万新发肺癌病例，160万例死亡病例，因分期和地区不同，肺癌患者5年生存率在4％
‑
17％。在中国的癌症死亡率中，肺癌仍然排名第一，2020年有72万国人死于肺癌，约占全球死亡人数一半。肺癌有临床症状发现时往往是晚期，因此患者已经丧失了手术根治的机会，一般选择靶向治疗，化疗或者放疗。肺癌是目前拥有最多靶向药的一个癌种，但众多的靶向药也给临床选药带来了纠结，面对同一个突变时，究竟哪种靶向药是最合适的，二代基因测序并不能给临床一个满意的回答。另外针对化疗药物的选择，目前只能根据指南和临床医生的经验选择，缺乏明确的个性化治疗的指导依据。
[0003]同时肺癌病人绝大多数在治疗过程中会出现靶向药物耐药，临床往往采取再次基因测序证实是否有新的突变继而采用新的靶向药物或化疗药物，在反复的耐药过程中，病人往往出现无药可用的局面，临床医生也束手无策，只能让病人直接试药，有没有一种可以代替病人试药的体外模型，这是临床肺癌治疗迫切需要解决的难题。
[0004]类器官是将具有干性潜能的细胞进行3D培养，从而形成相应器官的类似组织，类器官能最大程度地模拟体内组织结构及功能并能长期传代培养。目前已成功建立了肺、胃、小肠、大肠、肺脏、胰腺、前列腺等肿瘤类器官模型。肿瘤类器官的遗传背景与其来源肿瘤组织遗传背景高度一致：肿瘤类器官中的遗传突变与对应肿瘤活组织标本中的突变高度匹配，并与以往大规模的肿瘤突变分析结果相一致。肿瘤类器官也可以在基因表达谱、蛋白质谱、病理形态、肿瘤异质性等方面很好地模拟患者原位肿瘤。另外多项研究结果表明，类器官对药物的反应可以用来预测患者的临床疗效。例如一项关于囊性纤维化的研究表明，其类器官的药物反应情况与已发表的临床试验数据结果一致。2018年Science杂志一项最新研究表明，肿瘤类器官对药物的反应与转移性胃肠道肿瘤患者临床疗效高度一致，提示88％阳性预测率，100％的阴性预测率，为肿瘤类器官作为精准医疗的筛药工具提供了有力的支撑。
[0005]虽然原发肺癌类器官培养国内外已经有很多报道，但是复发肺癌穿刺样本因肿瘤细胞较少，原有培养体系不适合而培养成功率较低，因此复发肺癌穿刺样本类器官的成功培养和稳定药物敏感性测试可为复发肺癌的精准医疗提供可靠保证。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于，提供一种适宜复发性肺癌穿刺样本的类器官培养的培养基，进而获得复发肺癌类器官，以便能够研究复发肺癌发病机制和病程以及筛选相关抗癌药物。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供一种复发肺癌的类器官培养基，所述培养基成分包括如下成分：
[0008]DMEM/F12K/1640培养基(1:1:1
‑
2)，抗坏血酸(1
‑
100mg/L)，L
‑
谷氨酸(1
‑
100mg/L)，亚硒酸钠(0.002
‑
0.5mg/L)，乙醇胺盐酸盐(2
‑
200mg/L)，偏钒酸铵(1
×
10
‑4‑
20
×
10
‑4mg/L)，四水合氯化锰(5
×
10
‑5‑
50
×
10
‑5mg/L)。
[0009]R
‑
spondin1(50
‑
1000ng/ml)，Noggin(10
‑
200ng/ml)，N2:B27(0.1
‑
2)，谷氨酰胺补剂(1
×
)，HEPES(1
×
)，烟酰胺(1
‑
100mM)，Normocin
TM
(1
×
)，N
‑
乙酰半胱氨酸(0.1
‑
10mM)，Wnt3a(10
‑
500ng/ml)。
[0010]优选的，所述培养基中还包括肝素，进一步优选的，所述肝素浓度为10
‑
200IU/ml。
[0011]优选的，所述培养基中还包括A83
‑
01，进一步优选的，所述A83
‑
01浓度为0.1
‑
50μM。
[0012]优选的，所述培养基中还包括EGF，进一步优选的，所述EGF浓度为1
‑
200ng/ml。
[0013]优选的，所述培养基中还包括FGF2，进一步优选的，所述FGF2浓度为1
‑
100ng/ml。
[0014]优选的，所述培养基中还包括Gastrin I，进一步优选的，所述Gastrin I浓度为25nM。
[0015]优选的，所述培养基中还包括HGF，进一步优选的，所述HGF浓度为5
‑
500ng/ml。
[0016]优选的，所述培养基中还包括CHIR99021，进一步优选的，所述CHIR99021浓度为5
‑
20μM。
[0017]优选的，所述培养基中还包括DMSO，进一步优选的，所述DMSO浓度为培养基体积比的0.01
‑
2％。
[0018]本专利技术另一方面，提供了一种培养复发肺癌穿刺样本的培养方法，包括使用上述培养基以及优选的组分选择性的添加，能够对多种的复发肺癌穿刺样本实现类器官培养。
[0019]具体的，所述培养方法如下：
[0020]1.取复发肺癌穿刺样本，4℃保存于专用保存液中，24小时内低温转移至操作室；
[0021]2.样本低温破碎，酶解消化；
[0022]3.低温离心去除上清，冰PBS重悬；
[0023]4. 70g低温离心5
‑
10min，去除上清，冰PBS重悬，此过程重复3
‑
5次；
[0024]5. 200g低温离心10min，去除上清，依据获得细胞情况，1
‑
5ml冰PBS重悬后显微镜下计数细胞；
[0025]6. 300g低温离心10min，去除上清，依据细胞计数加入适量冰Matrigel重悬接种于24孔板，加入肺癌培养液，每3天更换一次相应培养液；
[0026]7.肿瘤类器官培养6
‑
12天后，每孔添加1ml冰PBS，反复吹打，移入15ml离心管；
[0027]8. 300g低温离心10min，去上清，冰PBS重悬，此步骤重复3
‑
5次，直至Matrigel全部清除
[0028]9.离心结束后，冰Matrigel重悬，1:3接种扩增；
[0029]10.待肿瘤类器官稳定传代后，重复步骤9，一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种复发肺癌细胞类器官培养基，其特征在于，所述培养基包含如下组分：DMEM/F12K/1640培养基1:1:1
‑
2，抗坏血酸1
‑
100mg/L，L
‑
谷氨酸1
‑
100mg/L，亚硒酸钠0.002
‑
0.5mg/L，乙醇胺盐酸盐2
‑
200mg/L，偏钒酸铵1
×
10
‑4‑
20
×
10
‑4mg/L，四水合氯化锰5
×
10
‑5‑
50
×
10
‑5mg/L，R
‑
spondin1 50
‑
1000ng/ml，Noggin10
‑
200ng/ml，N2:B27(0.1
×‑2×
)，谷氨酰胺补剂(1
×
)，HEPES(1
×
)，烟酰胺1
‑
100mM，Normocin
TM
(1
×
)，N
‑
乙酰半胱氨酸0.1
‑
10mM，Wnt3a10
‑
500ng/ml。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括以下物质的一种或多种：A83
‑
01、EGF，Gastrin I。3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述A83
‑
01浓度为0.1
‑
50μM；所述EGF浓度为10
‑
200ng/ml；所述Gastrin I浓度为5
‑
25nM。4.根据前述任一权利要求所述的培养基，其特征在于所述培养基中还包括下述物质的一种或多种的组合：肝素，FGF2，HGF，优选的，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋伟，柏卫华，
申请(专利权)人：柏卫华，
类型：发明
国别省市：