构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法技术

本发明专利技术属于肿瘤细胞体外培养，具体涉及构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法。本发明专利技术要解决的技术问题是为肠道尤文氏肉瘤类器官构建提供一种新选择。本发明专利技术的技术方案是构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法，包括如下步骤：样本预处理、清洗、消化、去除杂质、固化和培养。本发明专利技术提供了肠道尤文氏肉瘤的类器官构建方法，使用该类器官可以成功预测肿瘤对化疗药物的敏感性，为制定和实施个性化精准治疗方案提供了可能性。能性。能性。

【技术实现步骤摘要】
构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法


[0001]本专利技术属于肿瘤细胞体外培养，具体涉及构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法。

技术介绍

[0002]尤文氏肉瘤是一种原发恶性骨肿瘤，起源于骨髓未成熟的间叶细胞或网织细胞，骨外尤文氏肉瘤恶性程度很高，65%可出现血行转移。其治疗方式以手术结合化学治疗为主，且预后与化疗敏感度密切相关，但目前缺乏有效的化疗敏感性预测方式。既往采用细胞系或基因检测的方式预测化疗敏感性具有耗时或灵敏度度的缺点。
[0003]类器官是由干细胞在体外经过三维（Three dimensional, 3D）培养分化成多种细胞类型，并自我组织形成器官样结构的细胞群。与癌细胞系和PDTX（人源肿瘤异种移植模型，Patient
‑
Derived tumor Xenograft）相比，类器官具有组织需求量小、培养周期短、培养成功率高、能够保持原始肿瘤组织基因型和表型的稳定性、保留肿瘤间及肿瘤内异质性，并可以进行高通量药物筛选等优势。自2009年Hans Clever首次报道类器官，10余年来，类器官培养及药敏实验已成功在多种肿瘤类型上进行，如结直肠癌、胃癌、肝癌、胰腺癌和卵巢癌等。一些研究利用患者来源肿瘤类器官（Patient
‑
derived tumor organoid, PDTO）成功预测了患者的抗肿瘤治疗疗效。借助类器官临床前特异模型，能快速有效地识别对化疗患者，可以避免过度治疗以减少治疗引起的副作用，实施个性化精准治疗方案。因此，PDTO有望成为化疗疗效预判的新方法。但目前尚无肠道尤文氏肉瘤类器官构建及应用报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是为肠道尤文氏肉瘤类器官构建提供一种新选择。
[0005]本专利技术的技术方案是构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法，包括如下步骤：a、样本预处理：将切取的肿瘤组织用聚维酮碘溶液和0.9%氯化钠溶液依次冲洗2～3次后，放入含有5%青霉素/链霉素及2%promocin的RPMI 1640保存液中；b、清洗：去除RPMI 1640保存液，将组织加入到含有1
×
Glutamax、10mM HEPES和5%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液中，振荡清洗，静置5min；此步骤应重复2~3次；c、消化：去除步骤b中培养基，将清洗好的组织用剪刀剪碎至1mm
×
1mm大小，加入改良的DMEM/F12培养液，置入37℃水浴锅中消化60min，每隔15min剧烈振荡一次；d、去除杂质：将消化后的组织悬浮液转移至离心管中，加入10mL AdDF+++清洗2～3次后，过滤，收集滤液；向滤液中加入红细胞裂解液，处理完成后加入10mL AdDF+++，清洗，离心，弃掉上清，取沉淀物；e、固化：在冰上进行，沉淀物用HEPES缓冲液清洗，重悬，加入Matrigel，充分混匀；吸取细胞悬浮液滴入到预热的培养板中，37℃条件下固化5min；f、培养：将改良的DMEM/F12培养液加入固化后的Matrigel中，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱内培养；每2~4天更换培养基，直至类器官大小超过200微米或类器官长满基质胶。
[0006]进一步的，所述方法还包括步骤g、传代：去除培养液，PBS清洗，加入TrypLE Express，用移液枪吹打，将Matrigel打散，每隔10~15min吹打1次，直至类器官被消化成单个细胞；加入 1mL Advanced DMEM/F12培养基与TrypLE Express混合，200g离心5min，去除上清，将细胞沉淀用Advanced DMEM/F12 培养基重悬细胞，再加入Matrigel，充分混匀，进行传代培养，每2~4天更换培养基，每7～14天传代一次。
[0007]具体的，所述方法还包括步骤h、冻存：离心收集步骤f培养或步骤g传代获得的类器官，加入类器官冻存液，形成细胞悬液，转移至低温冻存管中，程序性降温，降温完成后将冻存管放入
‑
80℃深低温冰箱中，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
[0008]进一步的，所述方法还包括步骤i、复苏：将冻存管至于37℃，间歇摇动冻存管令其尽快融化，融化后加入advanced DMEM/F12培养基，混匀后200g离心5min，弃去上清液，保留细胞沉淀；加入advanced DMEM/F12重悬细胞沉淀，再加入Matrigel，混匀，吸取混合液至37℃条件下预热30min的培养板中， 5%CO2的37℃细胞培养箱内培养，冻存类器官复苏完成。
[0009]具体的，步骤b中，所述DMEM/F12培养液中含有Advanced DMEM/F12和AdDF+++。
[0010]其中，步骤c中，所述改良的DMEM/F12培养液含0.5～1.0mg/mL 的II型Collagenase、500U/mL的IV 型Collagenase和10
µ
M的RHO/ROCK pathway inhibitor 。
[0011]优选的，经步骤c处理后仍未成功消化的组织可用TrypLE Express在37℃水浴锅中继续消化20min。
[0012]进一步的，步骤d中，过滤参数为70
µ
m；离心参数为300g
×
5min。
[0013]其中，步骤e中，加入Matrigel充分混匀后，使细胞浓度为1
×
106/mL。
[0014]具体的，步骤f中，所述改良的DMEM/F12培养液以DMEM/F12培养液为基础，加入N
‑
Acetylcysteine、EGF、FGF
‑
10、FGF
‑
basic、Y
‑
27632、A
‑
83
‑
01、SB202190、Nicotinamide、PGE2、Noggin、 R
‑
Spondin、HEPES、GlutaMAX、B27、N2、青霉素和链霉素。
[0015]肿瘤药敏有人源肿瘤异种移植模型(Patient
‑
Derived tumor Xenograft,PDTX)和基因检测两种模式，PDTX即将病人的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷鼠而建立，与PDTX相比，类器官具有组织需求量小、培养周期短、培养成功率高、能够保持原始肿瘤组织基因型和表型的稳定性、保留肿瘤间及肿瘤内异质性，并可以进行高通量药物筛选等优势。 而基因检测根据基因突变预测药物敏感性，是一种间接的预测方式，其灵敏度不足。
[0016]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了肠道尤文氏肉瘤的类器官构建方法，使用该类器官可以成功预测肿瘤对化疗药物的敏感性，为制定和实施个性化精准治疗方案提供了可能性。该方法流程简单，制备过程易于标准化，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0017]图1为A
‑
D分别对应培养0天、5天、10天、15天的肠道尤文氏肉瘤类器官在显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.构建肠道尤文氏肉瘤类器官的方法，其特征在于，包括如下步骤：a、样本预处理：将切取的肿瘤组织用聚维酮碘溶液和0.9%氯化钠溶液依次冲洗2～3次后，放入含有5%青霉素/链霉素及2%promocin的RPMI 1640保存液中；b、清洗：去除RPMI 1640保存液，将组织加入到含有1
×
Glutamax、10mM HEPES和5%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养液中，振荡清洗，静置5min；此步骤应重复2~3次；c、消化：去除步骤b中培养基，将清洗好的组织用剪刀剪碎至1mm
×
1mm大小，加入改良的DMEM/F12培养液，置入37℃水浴锅中消化60min，每隔15min剧烈振荡一次；d、去除杂质：将消化后的组织悬浮液转移至离心管中，加入10mL AdDF+++清洗2～3次后，过滤，收集滤液；向滤液中加入红细胞裂解液，处理完成后加入AdDF+++，清洗，离心，弃掉上清，取沉淀物；e、固化：在冰上进行，沉淀物用HEPES缓冲液清洗，重悬，加入Matrigel，充分混匀；吸取细胞悬浮液滴入到预热的培养板中，37℃条件下固化5min；f、培养：将改良的DMEM/F12培养液加入固化后的Matrigel中，置于含5%CO2的37℃细胞培养箱内培养；每2~4天更换培养基，直至类器官大小超过200微米或类器官长满基质胶；步骤f中，所述改良的DMEM/F12培养液以DMEM/F12培养液为基础，加入N
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Acetylcysteine、EGF、FGF
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10、FGF
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basic、Y
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27632、A
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83
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01、SB202190、Nicotinamide、PGE2、Noggin、 R
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Spondin、HEPES、GlutaMAX、B27、N2、青霉素和链霉素。2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括步骤g、传代：去除培养液，PBS清洗，加入TrypLE Express，用移液枪吹打，将Matrigel打散，每隔1...

【专利技术属性】
技术研发人员：严俊，薛巍松，陈德鑫，陈振邦，王挺，唐雨婷，董小玉，董淑敏，蒋伟，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：