一种脐带间充质干细胞提取物分析及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种脐带间充质干细胞提取物分析及检测方法，包括步骤一，脐带间充质干细胞获取；步骤二，扩增培养；步骤三，脐带间充质干细胞提取物获取；步骤四，蛋白质提取；步骤五，蛋白质处理；步骤六，C18反相Tip柱除盐；步骤七，反相液质联用；其中上述步骤一中，采用磷酸缓冲液冲洗脐带表面，去除血污，然后将干净的脐带剪碎，获得脐带组织块；该发明专利技术在脐带间充质干细胞提取的过程中，通过向培养皿中添加高浓度的青链霉素，起到抗菌作用，减少了生物污染；在蛋白质提取时搅拌的过程中，通过多次开合外盖，提高散热，减少蛋白质的损失，提高蛋白质的提取效率；且该发明专利技术使用的分析检测方法较为全面，利于推广。利于推广。利于推广。

【技术实现步骤摘要】
一种脐带间充质干细胞提取物分析及检测方法


[0001]本专利技术涉及医药生物
，具体为一种脐带间充质干细胞提取物分析及检测方法。

技术介绍

[0002]由于间充质干细胞对于皮肤伤口的愈合及细胞外基质的重建，胶原和弹性蛋白的稳定生产及分布具有重要作用；因此，市场上对于脐带间充质干细胞提取物分析及检测方法的使用有了一定的要求；但是，现有的脐带间充质干细胞提取物的提取方法较为复杂，脐带间充质干细胞提取物的分析与检测方法较为简单、不够全面，检测方式较为复杂，影响使用；在脐带间充质干细胞提取过程中，大多没有设置减少生物污染步骤，影响使用；且在蛋白质提取的过程中，大多没有进行逐级散热步骤，容易造成蛋白质变性损失；因此，现阶段专利技术出一种脐带间充质干细胞提取物分析及检测方法是非常有必要的。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种脐带间充质干细胞提取物分析及检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出提取方法复杂、分析与检测方法较为简单、不够全面、没有设置减少生物污染步骤以及没有进行逐级散热步骤，容易造成蛋白质变性损失的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种脐带间充质干细胞提取物分析及检测方法，包括步骤一，脐带间充质干细胞获取；步骤二，扩增培养；步骤三，脐带间充质干细胞提取物获取；步骤四，蛋白质提取；步骤五，蛋白质处理；步骤六，C18反相Tip柱除盐；步骤七，反相液质联用；
[0005]其中上述步骤一中，采用磷酸缓冲液冲洗脐带表面，去除血污，然后将干净的脐带剪碎，获得脐带组织块，然后经过原代培养、干细胞的传代培养、干细胞的冻存、干细胞的复苏与培养和人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤后分离得到脐带间充质干细胞；
[0006]其中上述步骤二中，将步骤一得到的脐带间充质干细胞定向分化为皮肤干细胞；将定向分化得到的皮肤干细胞采用0.1％胰酶消化，用生理盐清洗一次；将脐带间充质干细胞接种在皮肤干细胞培养基中，于37℃、5％CO2环境下的培养箱中孵育15～20h，弃去培养基，重新加入新鲜的皮肤干细胞培养基中，待皮肤干细胞接近80～90％融合时，进行传代扩增培养；
[0007]其中上述步骤三中，将步骤二得到皮肤干细胞正常培养18～36h后，再置于氧气5％、二氧化碳5％、氮气90％的低氧环境下培养18～36h后，收集并裂解得到的皮肤干细胞，并通过孔径为0.3～2.0nm分子筛得到活性小分子物质，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物；
[0008]其中上述步骤四中，向装有细胞样品的EP管中加入300μL含有1％蛋白酶抑制剂的1％SDS溶液，冰浴超声破碎2min；然后21000
×
g4℃离心15min，取上清；然后采用BCA法测定蛋白质浓度；
[0009]其中上述步骤五中，对步骤四中获取的蛋白质溶液在95℃的温度下变性10min，然后冷却至室温；之后向离心管中加入3μL1M二硫苏糖醇，在56℃温度下恒温振荡1.5h；然后冷却至室温，加入6μL1M碘乙酰胺，避光反应30min；然后使用FASP酶解方法进行酶解，然后更换离心管，离心收集肽段混合物；
[0010]其中上述步骤六中，首先进行活化工作，使用1.5mL离子管固定Pep
‑
Tip除盐柱，加入200μLB，7000rpm离心5min；然后进行平衡工作，加入200μL的A，7000rpm离心5min；然后进行吸附样品工作，加入样品，5000rpm离心10min；然后进行脱盐处理工作，200μL的A清洗柱子，7000rpm离心5min；然后进行洗脱工作，更换低吸附离心管收集样品，200μL的B，7000rpm离心5min，冻干洗脱液；最后进行溶解工作，离心管中加入20μL的A，
‑
20℃下冻存，等待上样；
[0011]其中上述步骤七中，通过数据采集软件，设置相应的色谱条件和质谱条件，排除1价及高于7价的离子，动态排除时间60s，数据依赖采集模式，一个MS1图谱选择10个最强的母离子进行串级扫描。
[0012]优选的，所述步骤一中，脐带间充质干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1～2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple
‑
Express消化液，温度为37℃静置2～3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人源脐带间充质干细胞悬液。
[0013]优选的，所述步骤三中，皮肤干细胞采用冰浴超声破碎对皮肤干细胞进行裂解，冰浴超声破碎条件为间歇超声，超声破碎的功率300～350W，每工作10s，间歇3s，循环20～25次。
[0014]优选的，所述步骤四中，对于培养基样品，取1mL培养基，加入2mL甲醇，涡旋混匀，冰上静置5min；21000
×
g4℃离心15min，弃上清；加入300μL的1％SDS溶液，涡旋溶解蛋白质沉淀；然后采用BCA法测定蛋白质浓度。
[0015]优选的，所述步骤四中，冰浴超声破碎2min的过程中，先打开10s，然后关闭10s，如此循环2min，避免过热损失蛋白质。
[0016]优选的，所述步骤五中，FASP酶解方法为200μL50mM碳酸氢铵润洗超滤膜，取50μg处理的蛋白质上样至超滤膜上，离心去除缓冲溶液；加入200μL50mMABC溶液，充分将SDS去除；加入100μLpH8缓冲溶液，1μgTrypsin蛋白酶，37℃恒温振荡反应12h；最后加入5μL三氟乙酸，终止酶解。
[0017]优选的，所述步骤七中，色谱条件：分析柱平衡体积为5μL；上样量为3μL；Loading体积为8μL；色谱分离时间为120min；A为0.1％甲酸水溶液；B为80％乙腈，0.1％甲酸；流速为200nL/min；质谱条件：MS扫描范围为355
‑
1700m/z，分辨率为70000，最大离子注入时间为100ms，MS/MS离子注入时间为75ms，扫描范围为200
‑
2000，分辨率为35000，碎裂模式为高能碰撞，碎裂能量为27。
[0018]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：该专利技术安全、可靠，在脐带间充质干细胞提取的过程中，通过向培养皿中添加高浓度的青链霉素，起到抗菌作用，减少了生物污染；在蛋白质提取时搅拌的过程中，通过多次开合外盖，提高散热，减少蛋白质的损失，提高蛋
白质的提取效率；且该专利技术使用的分析检测方法较为全面，利于推广。
附图说明
[0019]图1为本专利技术的方法流程图。
具体实施方式
[0020]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脐带间充质干细胞提取物分析及检测方法，包括步骤一，脐带间充质干细胞获取；步骤二，扩增培养；步骤三，脐带间充质干细胞提取物获取；步骤四，蛋白质提取；步骤五，蛋白质处理；步骤六，C18反相Tip柱除盐；步骤七，反相液质联用；其特征在于：其中上述步骤一中，采用磷酸缓冲液冲洗脐带表面，去除血污，然后将干净的脐带剪碎，获得脐带组织块，然后经过原代培养、干细胞的传代培养、干细胞的冻存、干细胞的复苏与培养和人源脐带间充质干细胞制剂的制备步骤后分离得到目标脐带间充质干细胞；其中上述步骤二中，将步骤一得到的脐带间充质干细胞定向分化为皮肤干细胞；将定向分化得到的皮肤干细胞采用0.1％胰酶消化，用生理盐清洗一次；将脐带间充质干细胞接种在皮肤干细胞培养基中，于37℃、5％CO2环境下的培养箱中孵育15～20h，弃去培养基，重新加入新鲜的皮肤干细胞培养基中，待皮肤干细胞接近80～90％融合时，进行传代扩增培养；其中上述步骤三中，将步骤二得到皮肤干细胞正常培养18～36h后，再置于氧气5％、二氧化碳5％、氮气90％的低氧环境下培养18～36h后，收集并裂解得到的皮肤干细胞，并通过孔径为0.3～2.0nm分子筛得到活性小分子物质，将活性小分子物质进行富集得到脐带间充质干细胞提取物；其中上述步骤四中，向装有细胞样品的EP管中加入300μL含有1％蛋白酶抑制剂的1％SDS溶液，冰浴超声破碎2min；然后21000
×
g4℃离心15min，取上清；然后采用BCA法测定蛋白质浓度；其中上述步骤五中，对步骤四中获取的蛋白质溶液在95℃的温度下变性10min，然后冷却至室温；之后向离心管中加入3μL1M二硫苏糖醇，在56℃温度下恒温振荡1.5h；然后冷却至室温，加入6μL1M碘乙酰胺，避光反应30min；然后使用FASP酶解方法进行酶解，然后更换离心管，离心收集肽段混合物；其中上述步骤六中，首先进行活化工作，使用1.5mL离子管固定Pep
‑
Tip除盐柱，加入200μLB，7000rpm离心5min；然后进行平衡工作，加入200μL的A，7000rpm离心5min；然后进行吸附样品工作，加入样品，5000rpm离心10min；然后进行脱盐处理工作，200μL的A清洗柱子，7000rpm离心5min；然后进行洗脱工作，更换低吸附离心管收集样品，200μL的B，7000rpm离心5min，冻干洗脱液；最后进行溶解工作，离心管中加入20μL的A，
‑
20℃下冻存，等待上样；其中上述步骤七中，通过数据采集软件，设置相应的色谱条件和质谱条件，排除1价及高于7价的离子，动态排除时间60s，数据依赖采集模式，一个MS1图谱选择10个...

【专利技术属性】
技术研发人员：林志明，陈潮泽，
申请(专利权)人：深圳中安康华健康管理有限公司，
类型：发明
国别省市：