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一种外周血单个核细胞制备肝脏类器官的方法技术

技术编号:33648378 阅读:17 留言:0更新日期:2022-06-02 20:25
本发明专利技术公开了一种外周血单个核细胞(PBMCs)制备肝脏类器官的方法,本发明专利技术通过一种相对无创的方式获得具有个体遗传信息的,在体外充分模拟肝脏发育及肝脏相关疾病病理生理过程的肝脏类器官模型。将采集的PBMCs通过重编程为诱导多能干细胞(iPSCs),进一步iPSCs诱导分化为肝脏类器官,通过这两大步骤实现上述目标,且iPSCs可在体外无限扩增及保存,为肝脏类器官的规模化生产提供了基础。脏类器官的规模化生产提供了基础。脏类器官的规模化生产提供了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种外周血单个核细胞制备肝脏类器官的方法


[0001]本专利技术涉及干细胞
,具体地,涉及一种外周血单个核细胞制备肝脏类器官的方法。

技术介绍

[0002]肝脏是人体最大的代谢器官,基于肝脏的遗传代谢性疾病种类繁多,包括脂肪肝、先天性胆道闭锁、柠檬素缺乏症、α

1抗胰蛋白酶缺乏症、酪氨酸血症Ⅰ型、肝豆状核变性等等。这些肝脏疾病的发生发展研究需要良好的体内外模型,虽然国内外已根据各种疾病构建了多种动物模型,但是动物和人类在发育、生理结构和病理状态等方面存在较大差异,动物模型很难复制人类疾病的进展,因此亟需更优的疾病模型出现。
[0003]此时诱导多能干细胞的出现解决了这一问题,将具有患者遗传背景的多能干细胞系定向分化为类器官,可为遗传代谢疾病的个体化研究提供完整的发育及病理生理模型,为药物的筛选、基因治疗的实现提供更加安全的体外疾病模型。
[0004]同时,目前阶段,终末期肝病的唯一治愈手段只有肝脏移植,但供肝的短缺、移植后的免疫排斥反应及昂贵的费用把大部分患者拦在了治愈的门外。肝脏类器官也许是解决这一难题的重要突破点,将患者来源的肝脏类器官在体外扩增培养既可以解决供肝的短缺,也可以解决移植后排斥的问题。虽然现阶段类器官的培养昂贵且仍有很多不足,但未来可期。
[0005]诱导肝脏类器官的原理是获得肝脏祖细胞或者肝脏干细胞,由肝祖细胞或者肝干细胞进一步诱导分化为具有3D结构的肝脏类器官。目前获取人肝脏干细胞的方式主要有两种:
[0006]一种是从人体肝脏组织中通过分离培养获取的原代肝干细胞,但是获得肝脏组织是有创操作,尤其是对于肝功能异常或者衰竭的患者来说,肝穿刺或者肝切除等有创操作会大大增加出血风险或进一步加重肝功能恶化,因此获得肝脏组织有限而且困难。
[0007]另外一种重要的方式是模拟人体发育的过程,由人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSCs)通过诱导分化获得,由于iPSCs可以由志愿者外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)重编程获得,采血的过程简单且相对无创,因此由外周血单核细胞重编程得到iPSCs,后再由iPSCs进一步诱导分化取得可以传代和扩增的人类肝脏类器官,这也许将是未来替代人类肝脏器官的重要来源。

技术实现思路

[0008]目前已经存在肝脏类器官诱导方案是从原代肝脏祖细胞或者干细胞诱导得来,这种诱导方案虽可以获得和捐献者具有相同遗传背景的肝脏类器官,但是取材方式创伤过大,尤其是对于已经存在肝脏疾病或者肝衰竭的患者来说,风险极大。且原代来源的肝脏祖细胞或者干细胞在体外难以稳定扩增及保持其干细胞特性,如需要再次诱导仍需反复取材。本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足,提供一种外周血单个核细胞制备肝脏
类器官的方法。本专利技术解决了这一难题,即通过一种相对无创的方式获得具有个体遗传信息的,可以在体外充分模拟肝脏发育及肝脏相关疾病病理生理过程的肝脏类器官模型,且诱导多能干细胞可在体外无限扩增及保存,为肝脏类器官的反复及规模化生产提供了基础。
[0009]因此本专利技术的第一个目的是提供一种肝祖细胞球的增殖培养基。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供一种肝脏类器官的诱导培养基。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供所述肝祖细胞球的增殖培养基和/或、肝脏类器官的诱导培养基在制备肝脏类器官中的应用。
[0012]本专利技术的第四个目的是提供一种多能干细胞细胞制备肝脏类器官的方法。
[0013]本专利技术的第五个目的是提供任一所述方法制备得到的肝脏类器官。
[0014]同时,目前对肝脏祖细胞球的培养多采用在孔板底部滴入基质胶滴,建立一个圆顶(doom)的方式,但胶滴的贴壁面极易形成贴壁细胞,不利于基质胶内3D类器官的形成。且孔板底面积有限,制作的胶滴也就数量有限。本专利技术设计了一种可以通过简单的离心管及枪头即可实现的胶滴制作方法,采取此种方法培养3D类器官不会出现细胞贴壁生长的情况,且凝固的基质胶可以在普通细菌皿内批量培养,为3D类器官的规模培养提供了简单的方式。
[0015]为了实现上述目的,本专利技术是通过以下方案予以实现的:
[0016]一种肝祖细胞球的增殖培养基,所述增殖培养基为含有N

2羟乙基哌嗪

N
‑2‑
乙烷磺酸(HEPES)、GlutaMAX、乙酰半胱氨酸、N2、B27无血清细胞培养添加剂、烟酰胺、胃泌素、A83

01、Forskolin、R

spondin

1蛋白、Wnt3a蛋白、和表皮细胞生长因子EGF的DMEM/F12基础培养基。
[0017]优选地,所述增殖培养基为含有9~11mM N

2羟乙基哌嗪

N
‑2‑
乙烷磺酸、0.9~1.1%(体积比)GlutaMAX、1.20~1.3mM乙酰半胱氨酸、0.9~1.1(体积比)N2、0.9~1.1%(体积比)B27无血清细胞培养添加剂、9.5~10.5mM烟酰胺、9.5~10.5mM胃泌素、4.5~5.5μM A83

01、9.5~10.5μM Forskolin、245~255μM R

spondin

1蛋白、95~105μM Wnt3a蛋白、和45~55μM表皮细胞生长因子EGF的DMEM/F12基础培养基。
[0018]更优选地,所述增殖培养基为含有10mM N

2羟乙基哌嗪

N
‑2‑
乙烷磺酸、1%(体积比)GlutaMAX、1.25mM乙酰半胱氨酸、1%(体积比)N2、1%(体积比)B27无血清细胞培养添加剂、10mM烟酰胺、10mM胃泌素、5μM A83

01、10μM Forskolin、250μM R

spondin

1蛋白、100μM Wnt3a蛋白、和50μM表皮细胞生长因子EGF的DMEM/F12基础培养基。
[0019]一种肝脏类器官的诱导培养基,所述诱导培养基为含有牛血清白蛋白、B27细胞培养添加剂、ITS细胞培养添加物、L

ascorbic acid trisodium salt、乙酰半胱氨酸、肝细胞生长因子HGF蛋白、抑瘤素M、地塞米松、表皮细胞生长因子EGF蛋白、EGF、8



环磷酸腺苷、维生素K2、石胆酸、和Y27632的HM基础培养基。
[0020]优选地,所述诱导培养基为0.9~1.1(质量体积比)含有牛血清白蛋白、0.9~1.1%(体积比)B27细胞培养添加剂、0.9~1.1%(体积比)ITS细胞培养添加物、0.15~0.25mM L

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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝祖细胞球的增殖培养基,其特征在于,所述增殖培养基为含有N

2羟乙基哌嗪

N
‑2‑
乙烷磺酸、GlutaMAX、乙酰半胱氨酸、N2、B27无血清细胞培养添加剂、烟酰胺、胃泌素、A83

01、Forskolin、R

spondin

1蛋白、Wnt3a蛋白、和表皮细胞生长因子EGF的DMEM/F12基础培养基。2.一种肝脏类器官的诱导培养基,其特征在于,所述诱导培养基为含有牛血清白蛋白、B27细胞培养添加剂、ITS细胞培养添加物、L

ascorbic acid trisodium salt、乙酰半胱氨酸、肝细胞生长因子HGF蛋白、抑瘤素M、地塞米松、表皮细胞生长因子EGF蛋白、EGF、8



环磷酸腺苷、维生素K2、石胆酸、和Y27632的HM基础培养基。3.权利要求1所述肝祖细胞球的增殖培养基和/或权利要求2所述肝脏类器官的诱导培养基在制备肝脏类器官中的应用。4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,在多能干细胞制备肝脏类器官中的应用。5.一种多能干细胞细胞制备肝脏类器官的方法,其特征在于,包括以下步...

【专利技术属性】
技术研发人员:项鹏柯琼范明明李伟强
申请(专利权)人:中山大学
类型:发明
国别省市:

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