一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法、评价模型及其应用技术

本申请涉及皮肤炎症治疗用药物、化妆品筛选方法的技术领域，具体公开了一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法、评价模型及其应用。构建方法包括如下步骤：S1、制备致炎产物，并梯度稀释至不同浓度；培养得到HaCaT细胞；S2、于HaCaT细胞内分别添不同浓度的致炎产物，并进行培养；S3、通过监测细胞生长曲线，确定添加浓度，得到评价模型。本申请的评价模型可用于探究金黄色葡萄球菌在皮肤炎性中的反应机制、筛选抗炎原料和/或组合物和/或药物、筛选具有皮肤屏障修复作用的化妆品原料和/或组合物和/或产品中、化妆品安全性和/或功效评价；本申请的评价模型具有操作简单方便且应用广泛的优点。便且应用广泛的优点。便且应用广泛的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法、评价模型及其应用


[0001]本申请涉及皮肤炎症治疗用药物、化妆品筛选方法的
，更具体地说，它涉及一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法、评价模型及其应用。

技术介绍

[0002]皮肤作为人体第一道保护屏障，通过物理与生物学屏障阻止外界病原体伤害人体。在免疫系统进行特异性免疫反应之前可以通过皮肤的炎性反应减缓病毒对机体的损伤、减轻组织损伤与细胞坏死并保护人体内部。皮肤的重要组成部分是角质形成细胞，角质形成细胞在皮肤炎症中起到非常重要的作用，也是炎症的基础细胞，它组成了皮肤对外界的天然抗菌屏障。
[0003]皮肤炎症反应是指皮肤受到外界的物理（如温度、辐射、机械损伤）、化学或生物化学（如洗涤剂、香皂）、微生物等刺激而诱导细胞（如角质形成细胞、免疫细胞）与血管的一种反应现象。皮肤组织受到外界的刺激后，组成表皮层的主要细胞即角质形成细胞释放促炎因子（如IL
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1α、TNF
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α），同时释放趋化因子（如IL
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8），促炎因子进一步与细胞膜上对应的受体结合激活炎症相关信号通路（如NF
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κB通路），从而产生更多的炎症因子，加速花生四烯酸类物质分泌，导致炎症的级联放大。另外趋化因子会诱导免疫细胞如单核细胞发生浸透迁移，从而诱导血管反应，产生红斑等症状。
[0004]参与皮肤炎症反应的组份主要是：免疫反应相关细胞（如角质形成细胞和免疫细胞如巨噬细胞）、炎症因子（主要是一些小分子肽类物质，起到诱导和介导趋化的作用）炎性介质（小分子化合物，是花生四烯酸代谢产物，分为前列腺素类和白三烯类）、炎症相关的信号通路（典型的通路如NF
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κB信号通路，其中靶点基因主要是参与炎症反应的因子和酶）。
[0005]针对以上的炎症组分，也研究出一定的抗炎机制：抑制炎性介质的合成与分泌，主要的靶点是抑制炎性介质合成相关的酶或者标炎性介质，如环氧合酶COX；分泌炎性介质受体拮抗剂，合成释放的炎性介质与其对应的受体结合，激活下游的信号通路，进一步诱导炎症效应反应；抑制炎症因子的合成，主要是通过抑制炎症相关信号通路，典型的炎症相关信号通路为NF
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κB。
[0006]细菌也是引起皮肤氧化损伤和炎症的元凶之一，其中，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，在皮肤的感染疾病中占据重要地位，是皮炎湿疹患者、特异性皮炎患者感染的主要病原菌之一，同时可以在正常皮肤上被检测到，可引起炎症反应以及皮肤氧化应激反应，严重时造成局部化脓感染。
[0007]已有科学家研究关于金黄色葡萄球菌和皮肤微生态及常见皮肤各类疾病反应的关系，也有相应的动物实验基础，但动物模型只能在某些层面模拟疾病发生的状态，与人体存在较大差异，因此建立基于人体皮肤细胞的金黄色葡萄球菌侵染疾病模型是很有必要的。但是，现对于金葡菌的实验主要方向是关于金黄色葡萄球菌的侵染致病，而关于金黄色葡萄球菌致炎或免疫反应得相关研究较少。因此建立简单、易实施的一种基于金黄色葡萄
球菌的皮肤炎症体外评价模型及其构建方法是十分必要的。

技术实现思路

[0008]为了方便简单的获知金黄色葡萄球菌对人体皮肤的致炎或免疫的表现，本申请提供一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法、评价模型及其应用；其中该构建方法及评价模型简单、易实施，并且应用广泛。
[0009]第一方面，本申请提供一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法，采用如下的技术方案：一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：S1、制备致炎产物，并梯度稀释至不同浓度，备用，所述致炎产物由金黄色葡萄球菌增殖和/或代谢后产生；将复苏后的HaCaT细胞经细胞传代培养后，将对数生长期的HaCaT细胞以6000
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100000个细胞/孔的密度接种于培养板上培养后；S2、于所述培养板上培养有所述HaCaT细胞的不同孔内分别添加梯度稀释至不同浓度的所述致炎产物后，置于实时无标记细胞分析仪上进行培养；S3、通过实时无标记细胞分析仪监测细胞生长曲线，选择对HaCaT细胞的细胞增殖造成有影响且HaCaT细胞总存活率变化较为稳定的所述致炎产物的添加浓度，用于构建基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型。
[0010]通过采用上述技术方案，本申请通过该方法建立金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型，建立方法高效简单、成本低，得到的评价模型稳定。
[0011]可选的，于培养板上接种HaCaT细胞后的培养时间为20~30h；步骤S2中，于实时无标记细胞分析仪上进行培养的时间为45~52h。
[0012]可选的，所述致炎产物为灭菌的金黄色葡萄球菌液或者去除金黄色葡萄球菌后的金黄色葡萄球菌细胞培养液。
[0013]通过采用上述技术方案，金黄色葡萄球菌无法直接接入体外细胞培养体系，所以在实验中需要在保留细菌的致炎性的基础上做到减少细菌本身的活性，故选择经灭菌的金黄色葡萄球菌液或者经去除金黄色葡萄球菌菌体的金黄色葡萄球菌细胞培养液。可选的，致炎产物为经去除金黄色葡萄球菌菌体的金黄色葡萄球菌细胞培养液，其主要成分是多糖、蛋白质等物质，在避免金黄色葡萄球菌菌体本身的前提下，可以保留金黄色葡萄球菌的致炎机理。
[0014]可选的，所述构建方法中，以未处理的HaCaT细胞作为阴性对照组。
[0015]本申请中，“未处理的HaCaT细胞”指的是未添加任浓度的致炎产物的HaCaT细胞。
[0016]可选的，所述金黄色葡萄球菌细胞培养液由包括如下步骤的方法得到：取金黄色葡萄球菌于LB培养基中培养15~20h后，去除金黄色葡萄球菌菌体，留上清液即为金黄色葡萄球菌细胞培养液。
[0017]通过采用上述技术方案，培养得到的金黄色葡萄球菌细胞培养液中不含有金黄色葡萄球菌菌体，且其中含有的蛋白含量为2.45~2.60mg/mL，该蛋白混合物能够使得HaCaT细胞产生炎症反应，从而构建得到基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型。
[0018]可选的，步骤S1中，复苏HaCaT细胞的步骤包括：将HaCaT细胞悬浮于含有包括10Vol.%胎牛血清、1Vol.%青链霉素混合液的DMEM高糖培养基中，培养至细胞占据培养器底面75~85%时即可。
[0019]可选的，所述培养条件为：于32~37℃、2~7%二氧化碳以及饱和湿度的条件下培养。
[0020]可选的，对复苏后的HaCaT细胞进行细胞传代前，还包括细胞消化的步骤，所述细胞消化采用添加胰酶的方式实现。
[0021]第二方面，本申请提供一种采用上述构建方法得到的基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型，采用如下的技术方案：一种采用上述构建方法得到的基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型，所述评价模型采用包括以下步骤的方法得到：于HaCaT细胞中添加浓度为10~25Vol本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：S1、制备致炎产物，并梯度稀释至不同浓度，备用，所述致炎产物由金黄色葡萄球菌增殖和/或代谢后产生；将复苏后的HaCaT细胞经细胞传代培养后，将对数生长期的HaCaT细胞以6000
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100000个细胞/孔的密度接种于培养板上培养后；S2、于所述培养板上培养有所述HaCaT细胞的不同孔内分别添加不同浓度的所述致炎产物后，置于实时无标记细胞分析仪上进行培养；S3、通过实时无标记细胞分析仪监测细胞生长曲线，选择对HaCaT细胞的细胞增殖造成有影响且HaCaT细胞总存活率变化较为稳定的所述致炎产物的添加浓度，用于构建基于金黄色葡萄球菌的皮肤炎症体外评价模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，于培养板上接种HaCaT细胞后的培养时间为20~30h；步骤S2中，于实时无标记细胞分析仪上进行培养的时间为45~52h。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述致炎产物为灭菌的金黄色葡萄球菌液或者去除金黄色葡萄球菌后的金黄色葡萄球菌细胞培养液。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌细胞培养液由包括如下步骤的方法得到：取金黄色葡萄球菌于LB培养基中培养15~20h后，去除金黄色葡萄球菌菌体，留上清液即为金黄色葡萄球菌细胞培养液。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：张甜甜，王敏，徐鹤然，张晓娜，朱姿英，曹毓琳，白志惠，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：