一种用于检测新型冠状病毒（2019-nCoV）的CRISPR核酸检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测新型冠状病毒(2019‑nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒。本发明专利技术提供一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR‑Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白；a2)报告RNA，其由20个U组成；a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT‑RAA扩增引物，且所述RT‑RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域；本发明专利技术的CRISPR核酸检测试纸可通过CRISPR‑Cas13a系统实现对新型冠状病毒核酸的高灵敏、高特异、便捷检测，灵敏度达到10copies/test。

A novel coronavirus (2019-nCoV) detection kit for CRISPR nucleic acid

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒
本专利技术涉及一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒，属于分子诊断

技术介绍
新型冠状病毒肺炎(CoronaVirusDisease2019，COVID-19)是由新型冠状病毒(2019-nCoV)引起、导致人类发生急性感染的乙类传染病，具有传染性强、临床救治能力薄弱、无批准上市的特效药物及无疫苗预防的特点。新型冠状病毒的检测技术包括病毒基因测序、IgM和IgG抗体的检测、荧光定量PCR、恒温扩增芯片核酸检测技术等。然而现有检测技术均存在一定的不足，胶体金法简单便携，但灵敏度不足；包括LAMP、RPA在内的恒温扩增法灵敏度很高，但在操作过程中易污染；荧光定量PCR法和病毒基因测序稳定、可靠、具有一定的灵敏度，但样本处理复杂，且对仪器要求高。2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达到单碱基的核酸检测技术——基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK(SpecificHighSensitivityEnzymaticReporterUnLOCKing)，利用LeptotrichiawadeiCas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。2018年4月，美国研究人员将以上技术运用到社区现场检测中，专利技术了一种侧向流试纸，通过显线法显示目的核酸的存在，使此技术更加便捷。
技术实现思路
本专利技术一个目的是提供一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒。本专利技术提供的试剂盒，包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；所述用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统包括如下a1)-a3)；a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白(氨基酸序列为序列6)，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体；所述crRNA的靶点序列为序列1；a2)报告RNA，其由20个U组成，且所述报告RNA的序列两端分别标记FAM和生物素；a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT-RAA扩增引物，且所述RT-RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7RNA聚合酶识别的区域；所述侧向流试纸依次包括样品板(含有加样孔)、与纳米金抗FITC抗体、链亲和素线、抗体捕获线和吸收板；所述抗体捕获线包被的抗体为羊抗兔IgG。更进一步的，所述CRISPR-Cas13a系统还包括用于特异性扩增新型冠状病毒靶点序列的其他试剂，所述用于特异性扩增新型冠状病毒靶点序列的其他试剂包括如下试剂中的全部或部分：NTP(如NTPMix)、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、MgCl2溶液、HEPES缓冲液、RNasefreewater，具体见实施例中的表7中组分。上述试剂盒中，所述crRNA的核苷酸序列为序列2。上述试剂盒中，所述RT-RAA扩增引物由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。上述试剂盒中，所述CRISPR-Cas13a系统还包括a4)RNA聚合酶。上述试剂盒中，所述试剂盒还包括记载如下检测方法的可读载体：所述检测方法包括如下步骤:b1、提取待测样本的核酸，所述RT-RAA扩增所需引物对待测样品核酸进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物；上述RT-RAA扩增的反应条件为：37-42℃反应15-40分钟；b2、将所述RT-RAA扩增产物、所述crRNA、所述LwCas13a蛋白在含有所述报告RNA的体系中反应，得到反应产物；上述反应的条件为：37℃，15-30分钟。b3、将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中，静置观察；静置时间为液体滴在试纸上2-5分钟；若试纸没有T线显现且有C线显现，则待测样本含有或候选含有新型冠状病毒；若试纸有T线显现且有C线显现，则待测样本不含有或候选不含有新型冠状病毒。上述试剂盒中的用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统也是本专利技术保护的范围。上述试剂盒或上述CRISPR-Cas13a系统或上述系统中的单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体在如下c1-c10任一中的应用也是本专利技术保护的范围：c1)检测或辅助检测新型冠状病毒；c2)制备检测或辅助检测新型冠状病毒产品；c3)检测或辅助检测新型冠状病毒核酸；c4)制备检测或辅助检测新型冠状病毒核酸产品；c5)检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒；c6)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒产品；c7)检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒核酸；c8)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒核酸产品；c9)筛选或辅助筛选新型冠状病毒防治药物；c10)制备筛选或辅助筛选新型冠状病毒防治药物产品。本专利技术另一个目的是提供一种检测或辅助检测新型冠状病毒核酸的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：b1、提取待测样本的核酸，所述RT-RAA扩增所需引物对待测样品核酸进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物；b2、将所述RT-RAA扩增产物、所述crRNA、所述LwCas13a蛋白在含有所述报告RNA的体系中反应，得到反应产物；b3、将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中，静置观察；若试纸没有T线显现且有C线显现，则待测样本含有或候选含有新型冠状病毒；若试纸有T线显现且有C线显现，则待测样本不含有或候选不含有新型冠状病毒。上述待测样本可为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液，也可为血液样本、器官(如肝、脾、肾等)组织样本、细胞等。本专利技术所提供的检测或辅助检测新型冠状病毒的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在细胞水平筛选新型冠状病毒防治药物时检测用药前后细胞内是否含有新型冠状病毒。本专利技术基于CRISPR-Cas13a核酸检测技术，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于新型冠状病毒检测的靶点序列及能靶向该靶点序列的特异性crRNA，并提供一种基于消线法的侧向流试纸，该试纸可通过CRISPR-Cas13a系统实现对新型冠状病毒核酸的高灵敏、高特异、便捷检测，灵敏度达到10copies/test。附图说明图1为基于消线法侧向流试纸原理模式图。图2为RT-RAA扩增引物组合F1-R1扩增效率最高。图3为报告RNA(20U)对RNA酶最敏感。图4为CRISPR核酸检测试纸检测新型冠状病毒的灵敏度可达到1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；/n所述用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统包括如下a1)-a3)；/na1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体；/n所述crRNA的靶点序列为序列1；/na2)报告RNA，其由20个U组成，且所述报告RNA的序列两端分别标记FAM和生物素；/na3)用于扩增待测样本靶点序列的RT-RAA扩增引物，且所述RT-RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域；/n所述侧向流试纸依次包括样品板、与纳米金抗FITC抗体、链亲和素线、抗体捕获线和吸收板；/n所述抗体捕获线包被的抗体为羊抗兔IgG。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；
所述用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统包括如下a1)-a3)；
a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体；
所述crRNA的靶点序列为序列1；
a2)报告RNA，其由20个U组成，且所述报告RNA的序列两端分别标记FAM和生物素；
a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT-RAA扩增引物，且所述RT-RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7RNA聚合酶识别的区域；
所述侧向流试纸依次包括样品板、与纳米金抗FITC抗体、链亲和素线、抗体捕获线和吸收板；
所述抗体捕获线包被的抗体为羊抗兔IgG。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述crRNA的核苷酸序列为序列2。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述RT-RAA扩增引物由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。


4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述CRISPR-Cas13a系统还包括a4)RNA聚合酶。


5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒还包括记载如下检测方法的可读载体：
所述检测方法包括如下步骤:
b1、提取待测样本的核酸，所述RT-RAA扩增所需引物对待测样品核酸进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物；
b2、将所述RT-RAA扩增产物、所述crRNA、所述LwCas13a蛋白在含有所述报告RNA的体系中反应，得到反应产物；
b3、将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中，静置观察；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：李浩，寇志华，孙岩松，周育森，董雪，王彦贺，何雷，赵忠鹏，孙世慧，谷宏婧，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11