一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、方法及引物探针组合物技术

本发明专利技术是一种用于同步检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、S基因和人B2M基因的多重反转录实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针组合，该试剂盒采用单管四荧光通道同时检测三个2019新型冠状病毒基因和一个人内参基因，能检测呼吸道和血液样本中2019新型冠状病毒RNA的存在。本发明专利技术检测周期短、特异性强、灵敏度高、漏检率低、重复性好，能通过对人内参基因的检测结果对样本的提取和扩增过程进行质量监控，并通过dUTP‑UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染导致的假阳性结果出现。

Novel coronavirus multidetector real-time PCR kit, method and primer probe for detection of 2019 new coronaviruses

【技术实现步骤摘要】
一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、方法及引物探针组合物
本专利技术涉及核酸检测
，具体涉及一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、方法及引物探针组合物。
技术介绍
人感染2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)后导致的肺炎称为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，常见体征包括呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难，在重症病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭甚至死亡，截止目前尚无特异性治疗方法，因此早发现早隔离是最为有效的遏制疫情发展的措施。国家卫健委发布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中明确指出，新型冠状病毒感染的检测方法为反转录实时荧光定量PCR，且检测方法主要针对新型冠状病毒基因组开放阅读框1ab(openreadingframe1ab，ORF1ab)和核壳蛋白(nucleocapsidprotein，N)，若同一份标本中新型冠状病毒两个靶标特异性反转录实时荧光定量PCR检测结果均为阳性，则判定病例为阳性，但是同时指南也指出，由于病毒变异导致阴性情况的存在，阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服
技术介绍
的技术缺陷，提供一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、方法及引物探针组合物。本专利技术试剂盒采用单管四荧光通道同时检测三个2019新型冠状病毒基因(ORF1ab基因、N基因和S基因)和一个人内参基因(B2M基因)，设计检测针对呼吸道和血液等样本中的2019新型冠状病毒RNA。本专利技术检测周期短、特异性强、灵敏度高、漏检率低、重复性好，使用人内参基因内标可以做到对检测中样本的提取和扩增全过程进行质量监控，并通过dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染导致的假阳性结果出现。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术所提供的用于对2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、S基因和人B2M基因的多重反转录实时荧光定量PCR检测试剂盒主要包括2019新型冠状病毒检测预混液、RT-PCR酶液(包含逆转录酶、热启动rTaq酶以及UNG酶)、2019新型冠状病毒阳性对照、2019新型冠状病毒阴性对照。2019新型冠状病毒检测预混液中包括多重反转录实时荧光定量PCR反应所需的dNTP、dUTP、Mg2+、缓冲液、用于扩增2019新型冠状病毒ORFlab基因、N基因、S基因和人B2M基因的引物、用于检测2019新型冠状病毒ORFlab基因、N基因、S基因和人B2M基因的探针(表1)。用于扩增和检测2019新型冠状病毒的正反向引物序列和探针序列信息如表2所示；其中，用于检测2019新型冠状病毒ORFlab基因的探针5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1；用于检测2019新型冠状病毒N基因的探针5’端添加荧光报道基团Cy5，3’端添加荧光猝灭就团BHQ-2；用于检测2019新型冠状病毒S基因的探针5’端添加荧光报道基团ROX，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；用于检测人B2M基因的探针5’端添加荧光报道基团VIC，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2。由上述正反向引物和探针序列的衍生序列也属于本
技术实现思路
，所述衍生序列是指在SEQIDNO：1～12的基础上在序列的5’端或3’端添加或减少一个或多个碱基得到的序列。为避免多重反转录实时荧光定量PCR过程中被延伸，所述探针的3’端已经过磷酸化处理。表12019新型冠状病毒检测预混液各组分配比(单次反应)表2用于扩增和检测2019新型冠状病毒的引物和探针序列RT-PCR酶液中包含逆转录酶、热启动rTaq酶以及UNG酶，其组分配比详见表3。表3RT-PCR酶液各组分配比(单次反应)2019新型冠状病毒阳性对照为包含2019新冠状病毒ORF1ab基因、N基因和S基因序列的质粒。2019新型冠状病毒阴性对照为H2O。进一步地，所述试剂盒的检测方法为通过对疑似患者呼吸道、血液等样本进行RNA提取，配制扩增反应体系后进行多重反转录实时荧光定量PCR扩增，并对得到的扩增曲线进行分析，并作出阴阳性判断。具体使用方法包括以下步骤：(1)采用核酸自动提取仪对样本总核酸进行提取；(2)取提取得到的核酸，按照表4配制多重反转录实时荧光定量PCR反应体系；表4多重反转录实时荧光定量PCR反应体系RT-PCR反应试剂加样量(μL)2019新型冠状病毒检测预混液14RT-PCR酶液1待检测的核酸样本/阴阳对照品5总体积20(3)根据表5设定反应程序进行多重反转录实时荧光定量PCR反应。表5多重反转录实时荧光定量PCR反应程序(4)根据多重反转录实时荧光定量PCR扩增结果，对检测结果进行判读，其判定依据如下：阴性结果判读标准为：VIC通道的Ct值≤38，且其他荧光信号通道的Ct值结果≥38或显示为Undetermined/NoCt；阳性结果判读标准为：当检测结果FAM/ROX/Cy5通道中有2个或3个通道的扩增曲线呈明显S型曲线，且Ct值≤38，则样本判断为阳性；灰区结果判读标准为：当检测结果FAM/ROX/Cy5通道只有1个通道的扩增曲线呈明显S型曲线且Ct值≤38，则需重新检测；当检测FAM/ROX/Cy5通道的Ct值在38～40之间，且扩增曲线呈典型S型，则需再次复合，若结果依然为灰区结果或阳性结果，且扩增曲线呈现S型，则判定为阳性，否则判定为阴性。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术公开了一种检测2019新型冠状病毒的多重实时荧光定量PCR试剂盒、方法及引物探针组合物，该试剂盒采用单管四荧光通道同时检测三个2019新型冠状病毒基因和一个人内参基因，能检测疑似患者呼吸道样本、血液等样本中2019新型冠状病毒RNA的存在。本专利技术检测周期短、特异性强、灵敏度高、漏检率低、重复性好，能通过对人内参基因的检测结果对样本的提取和扩增过程进行质量监控，并通过dUTP-UNG酶防污染体系降低由气溶胶污染导致的假阳性判定出现。附图说明图1为样本A1多重反转录实时荧光定量PCRCy5通道扩增曲线；图2为样本A1多重反转录实时荧光定量PCRFAM通道扩增曲线；图3为样本A1多重反转录实时荧光定量PCRROX通道扩增曲线；图4为样本A1多重反转录实时荧光定量PCRVIC通道扩增曲线；图5为样本A2多重反转录实时荧光定量PCRCy5通道扩增曲线；图6为样本A2多重反转录实时荧光定量PCRFAM通道扩增曲线；图7为样本A2多重反转录实时荧光定量PCRROX通道扩增曲线；图8为样本A2多重反转录实时荧光定量PCRVIC通道扩增曲线；图9为样本B1多重反转录实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测2019新型冠状病毒的引物探针组合物，其特征在于，/n包括用于扩增2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、S基因和人B2M基因的引物、以及用于检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、S基因和人B2M基因的相应探针；/n所述用于扩增2019新型冠状病毒ORF1ab基因的正向引物序列为5’-TGTTAATGCCTATATTAACCTTGACCA-3’，如SEQ ID NO：1所示，用于扩增2019新型冠状病毒ORF1ab基因的反向引物序列为5’-GTGAGTTTTAACCTCTCTTCCGTG-3’，如SEQ ID NO：2所示；/n所述用于扩增2019新型冠状病毒N基因的正向引物序列为5’-GACAAGGCGTTCCAATTAACAC-3’，如SEQ ID NO：3所示，用于扩增2019新型冠状病毒N基因的反向引物序列为5’-GAGATCTTTCATTTTACCGTCACC-3’，如SEQ ID NO：4所示；/n所述用于扩增2019新型冠状病毒S基因的正向引物序列为5’-TCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACA-3’，如SEQ ID NO：5所示，用于扩增2019新型冠状病毒S基因的反向引物序列为5’-GTGAGACATATTCAAAAGTGCAATTATTCG-3’，如SEQ ID NO：6所示；/n所述用于扩增人B2M基因的正向引物序列为5’-GTTGAGTATGCCTGCCGTGT-3’，如SEQ IDNO：7所示，用于扩增人B2M基因的反向引物序列为5’-ATGCGGCATCTTCAAACCT-3’，如SEQ IDNO：8所示；/n所述用于检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因的探针序列为5’-TTGACACTGACTTAACAAAGCCTTACATTAAG-3’，如SEQ ID NO：9所示；/n所述用于检测2019新型冠状病毒N基因的探针序列为5’-ACTACCGAAGAGCTACCAGACGA-3’，如SEQ ID NO：10所示；/n所述用于检测2019新型冠状病毒S基因的探针序列为5’-AAACTCTGAACTCACTTTCCATCCAACT-3’，如SEQ ID NO：11所示；/n所述用于检测人B2M基因的探针序列为5’-ATGATGCTGCTTACATGTCTCGATCC-3’，如SEQID NO：12所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测2019新型冠状病毒的引物探针组合物，其特征在于，
包括用于扩增2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、S基因和人B2M基因的引物、以及用于检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、S基因和人B2M基因的相应探针；
所述用于扩增2019新型冠状病毒ORF1ab基因的正向引物序列为5’-TGTTAATGCCTATATTAACCTTGACCA-3’，如SEQIDNO：1所示，用于扩增2019新型冠状病毒ORF1ab基因的反向引物序列为5’-GTGAGTTTTAACCTCTCTTCCGTG-3’，如SEQIDNO：2所示；
所述用于扩增2019新型冠状病毒N基因的正向引物序列为5’-GACAAGGCGTTCCAATTAACAC-3’，如SEQIDNO：3所示，用于扩增2019新型冠状病毒N基因的反向引物序列为5’-GAGATCTTTCATTTTACCGTCACC-3’，如SEQIDNO：4所示；
所述用于扩增2019新型冠状病毒S基因的正向引物序列为5’-TCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACA-3’，如SEQIDNO：5所示，用于扩增2019新型冠状病毒S基因的反向引物序列为5’-GTGAGACATATTCAAAAGTGCAATTATTCG-3’，如SEQIDNO：6所示；
所述用于扩增人B2M基因的正向引物序列为5’-GTTGAGTATGCCTGCCGTGT-3’，如SEQIDNO：7所示，用于扩增人B2M基因的反向引物序列为5’-ATGCGGCATCTTCAAACCT-3’，如SEQIDNO：8所示；
所述用于检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因的探针序列为5’-TTGACACTGACTTAACAAAGCCTTACATTAAG-3’，如SEQIDNO：9所示；
所述用于检测2019新型冠状病毒N基因的探针序列为5’-ACTACCGAAGAGCTACCAGACGA-3’，如SEQIDNO：10所示；
所述用于检测2019新型冠状病毒S基因的探针序列为5’-AAACTCTGAACTCACTTTCCATCCAACT-3’，如SEQIDNO：11所示；
所述用于检测人B2M基因的探针序列为5’-ATGATGCTGCTTACATGTCTCGATCC-3’，如SEQIDNO：12所示。


2.如权利要求1所述的一种检测2019新型冠状病毒的引物探针组合物，其特征在于，用于检测2019新型冠状病毒ORF1ab基因的探针序列为如SEQIDNO：9所示，探针5’端添加荧光报告基团FAM，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-1；用于检测2019新型冠状病毒N基因的探针序列如SEQIDNO：10所示，探针5’端添加荧光报道基团Cy5，3’端添加荧光猝灭就团BHQ-2；用于检测2019新型冠状病毒S基因的探针序列如SEQIDNO：11所示，探针5’端添加荧光报道基团ROX，3’端添加荧光猝灭基团BHQ-2；用于检测人B2M基因的探针序列如SEQIDNO：12所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张迪骏，曾县平，张顺，吴勇，
申请(专利权)人：宁波海尔施基因科技有限公司，中国科学院大学宁波华美医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33