用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物及实时荧光定量PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物及实时荧光定量PCR试剂盒，能够用于检测副流感病毒1型、2型、3型和4型中的至少两种。本发明专利技术的引物探针组合物中，四组引物和探针均具有优异的特异性，能够特异性地对相应的副流感病毒血清型进行分型检测，其中，第①组引物和探针能够特异扩增副流感病毒1型HN基因，第②组引物和探针能够特异性扩增副流感病毒2型L基因，第③组引物和探针能够特异性扩增副流感病毒3型L基因，第④组引物和探针能够特异性扩增副流感病毒4型F基因，不同组的引物和探针不相干扰，对副流感病毒四种血清型的分型效果优异，检测灵敏度、准确性也较高。

【技术实现步骤摘要】
用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物及实时荧光定量PCR试剂盒
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物及实时荧光定量PCR试剂盒。
技术介绍
副流感病毒是属于副黏病毒属的一类有包膜的单股负链RNA病毒，是一种常见的呼吸道感染病原体，主要引起婴幼儿及儿童严重的下呼吸道感染疾病，目前缺乏有效的治疗药物和病毒疫苗。根据遗传性和抗原性，副流感病毒可以分为1型、2型、3型和4型，1-3型副流感病毒是较为常见的引起婴幼儿急性呼吸道感染的重要病原体，4型仅会引起症状较轻的婴幼儿呼吸道感染。副流感病毒所引起的感染症状和流感病毒较为相似，仅依靠临床症状及常规的检测方法进行病毒病原的确定并不可靠。因此早期快速对呼吸道病毒感染的病原进行诊断能够及时指导临床治疗，为合理选择抗病毒药物提供依据，避免药物滥用。为了解决上述问题，公开号为CN108676913A的中国专利技术专利申请公开了一种人副流感病毒核酸免提取基因分型检测试剂盒，该试剂盒分别针对副流感病毒1型、2型、3型和4型设计引物和探针，直接对咽拭子样本和血清样本进行多重实时荧光定量PCR扩增，最终实现对副流感病毒的分型检测。众所周知，对病毒进行分型检测的难度主要集中于特异性引物的设计，由于是需要在亚型的层级对副流感病毒1-4型进行区分，因此对引物的自身型保守性和对其他型别的特异性存在非常高的要求。若引物或探针设计不当，就会出现假阳性和假阴性的检测结果。上述检测试剂盒则存在以下不足：(1)引物特异性较差，可能引起较为严重的漏检现象或脱靶效应，导致出现假阴性或假阳性结果；(2)各副流感病毒血清型的特异性引物的Tm值存在较大差异，使得检测结果的准确性偏低；(3)引物在对各副流感病毒进行分型检测时的灵敏度较差。
技术实现思路
本申请的专利技术目的是提供一种用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物及实时荧光定量PCR试剂盒，该引物探针组合物能够对副流感病毒1型、2型、3型和4型中的至少两种进行快速的分型检测，各引物和探针对目标血清型的目标基因特异性强，且检测灵敏度高。为实现上述专利技术目的，本申请的技术方案如下：一种用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物，用于检测副流感病毒1型、2型、3型和4型中的至少两种，其中，①用于检测副流感病毒1型的引物和探针包括：具有如SEQNo.1所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQIDNo.2所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQIDNo.3所示核苷酸序列的探针；②用于检测副流感病毒2型的引物和探针包括：具有如SEQNo.4所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQIDNo.5所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQIDNo.6所示核苷酸序列的探针；③用于检测副流感病毒3型的引物和探针包括：具有如SEQNo.7所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQIDNo.8所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQIDNo.9所示核苷酸序列的探针；④用于检测副流感病毒4型的引物和探针包括：具有如SEQNo10所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQIDNo.11所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQIDNo.12所示核苷酸序列的探针。本专利技术的引物探针组合物中，四组引物和探针均具有优异的特异性，能够特异性地对相应的副流感病毒血清型进行分型检测，其中，第①组引物和探针能够特异扩增副流感病毒1型HN基因，第②组引物和探针能够特异性扩增副流感病毒2型L基因，第③组引物和探针能够特异性扩增副流感病毒3型L基因，第④组引物和探针能够特异性扩增副流感病毒4型F基因，不同组的引物和探针不相干扰，对副流感病毒四种血清型的分型效果优异。本专利技术的四组引物间的Tm值差异小(在±2°范围内)，当将四组引物和探针同时使用时，在相同的PCR温度条件下，各组引物与模板的结合能力较为一致，不仅方便PCR反应体系的调整和优化，而且能够确保各组引物的检测结果均具有较高的准确性。本专利技术的四组引物和探针对各自对应的毒流感病毒血清型的检测灵敏度高，经检测，第①组引物和探针对副流感病毒1型HN基因的最低检出限为5.7×101copies/μL；第②组引物和探针对副流感病毒2型L基因的最低检出限为7.2×101copies/μL；第③组引物和探针对副流感病毒3型L基因的最低检出限为9.6×101copies/μL；第④组引物和探针对副流感病毒4型F基因的最低检出限为4.8×101copies/μL。本专利技术中，上述SEQIDNo.1-12所示的核苷酸序列可以是相应引物和探针的完整序列，也可以是相应引物和探针的完整序列中的部分片段，本领域技术人员可以在本专利技术公开的SEQIDNo.1-12所示的核苷酸序列的5’端或3’端增加一个或多个碱基来获得不同的引物和探针，这些引物和探针都在本专利技术的保护范围之内。作为优选，上述的用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物用于检测副流感病毒1型、2型、3型和4型，其中，①用于检测副流感病毒1型的引物和探针为：正向引物：5’-CTAATTGTAAAACCTGATATGACTTCCC-3’；反向引物：5’-CAATTGGTGATGCAATATATGCGT-3’；探针：5’-荧光报告基团-TCTGCACATCCTTGAGTGATTAAGTTTGATGA-荧光淬灭基团-3’；②用于检测副流感病毒2型的引物和探针为：正向引物：5’-ACACGTTTAATTAATTCAGATTTAGCTAC-3’；反向引物：5’-CTAGGGCACTTCCCGCA-3’；探针：5’-荧光报告基团-TTGCCAGAGAAGAATCCAATCTTGCTGA-荧光淬灭基团-3’；③用于检测副流感病毒3型的引物和探针为：正向引物：5’-TGTAATTGTGCTATTTTACCTTTAACGA-3’；反向引物：5’-AAAAACTTAGGAGCAAAGCGTG-3’；探针：5’-荧光报告基团-ACACAGTGCCATTGTTAGATTCAGT-荧光淬灭基团-3’；④用于检测副流感病毒4型的引物和探针为：正向引物：5’-CCAGAARTCCAWAAATAGTACTTTTCGA-3’；反向引物：5’-TCRGTYGATAAATCAAGAGGAGTCA-3’；探针：5’-荧光报告基团-AAGTAGTTWTAGAATCTACTCARGTYAGATCTT-荧光淬灭基团-3’；用于检测四种副流感病毒的各探针中含有的荧光报告基团各不相同。作为优选，在上述的用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物中，用于检测四种副流感病毒的各探针中含有的荧光报告基团分别选自FAM、Cy5、ROX或VIC，用于检测四种副流感病毒的各探针中含有的荧光淬灭基团选自BHQ-1或BHQ-2。以第①、②、③和④组所含探针中的荧光报告基团依次为FAM、Cy5、ROX和VIC为例，在经多重RT-qP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物，其特征在于，用于检测副流感病毒1型、2型、3型和4型中的至少两种，其中，/n①用于检测副流感病毒1型的引物和探针包括：具有如SEQ No.1所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQ ID No.2所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQ ID No.3所示核苷酸序列的探针；/n②用于检测副流感病毒2型的引物和探针包括：具有如SEQ No.4所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQ ID No.5所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQ ID No.6所示核苷酸序列的探针；/n③用于检测副流感病毒3型的引物和探针包括：具有如SEQ No.7所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQ ID No.8所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQ ID No.9所示核苷酸序列的探针；/n④用于检测副流感病毒4型的引物和探针包括：具有如SEQ No10所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQ ID No.11所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQ ID No.12所示核苷酸序列的探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物，其特征在于，用于检测副流感病毒1型、2型、3型和4型中的至少两种，其中，
①用于检测副流感病毒1型的引物和探针包括：具有如SEQNo.1所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQIDNo.2所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQIDNo.3所示核苷酸序列的探针；
②用于检测副流感病毒2型的引物和探针包括：具有如SEQNo.4所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQIDNo.5所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQIDNo.6所示核苷酸序列的探针；
③用于检测副流感病毒3型的引物和探针包括：具有如SEQNo.7所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQIDNo.8所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQIDNo.9所示核苷酸序列的探针；
④用于检测副流感病毒4型的引物和探针包括：具有如SEQNo10所示核苷酸序列的正向引物、具有如SEQIDNo.11所示核苷酸序列的反向引物以及具有如SEQIDNo.12所示核苷酸序列的探针。


2.如权利要求1所述的用于副流感病毒分型检测的引物探针组合物，其特征在于，用于检测副流感病毒1型、2型、3型和4型，其中，
①用于检测副流感病毒1型的引物和探针为：
正向引物：5’-CTAATTGTAAAACCTGATATGACTTCCC-3’；
反向引物：5’-CAATTGGTGATGCAATATATGCGT-3’；
探针：5’-荧光报告基团-TCTGCACATCCTTGAGTGATTAAGTTTGATGA-荧光淬灭基团-3’；
②用于检测副流感病毒2型的引物和探针为：
正向引物：5’-ACACGTTTAATTAATTCAGATTTAGCTAC-3’；
反向引物：5’-CTAGGGCACTTCCCGCA-3’；
探针：5’-荧光报告基团-TTGCCAGAGAAGAATCCAATCTTGCTGA-荧光淬灭基团-3’；
③用于检测副流感病毒3型的引物和探针为：
正向引物：5’-TGTAATTGTGCTATTTTACCTTTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：张迪骏，赵林清，徐智，钱渊，梁宜，朱汝南，曾县平，孙宇，余丁，陈冬梅，吴勇，
申请(专利权)人：宁波海尔施基因科技有限公司，首都儿科研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33