检测黄颡鱼小RNA病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测黄颡鱼小RNA病毒‑1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒，其中，黄颡鱼小RNA病毒‑1荧光定量检测试剂盒包括特异性引物组A和Taqman荧光探针B；本发明专利技术采用荧光定量技术，通过检测黄颡鱼小RNA病毒‑1的衣壳蛋白基因，来检测黄颡鱼小RNA病毒‑1，这是目前国内外首次研制检测黄颡鱼小RNA病毒‑1的引物组和试剂盒。该试剂盒的研制为黄颡鱼小RNA病毒‑1病的监测和预防奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
检测黄颡鱼小RNA病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒
本专利技术属于靶RNA片断的快速检测领域，具体地说，涉及一种检测黄颡鱼小RNA病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒。
技术介绍
黄颡鱼小RNA病毒-1(YellowcatfishPicornavirus，YCPRV-1)是黄颡鱼潜在的致病性病原。其对黄颡鱼具有一定的致病力，常引起黄颡鱼体表出血、肠炎，少数病鱼肝脏有出血点。其引起的疾病对黄颡鱼养殖产业危害较大。YCPRV-1为单链RNA病毒，属于小RNA病毒科，未确定属的分类地位，通过基因组比较发现，与该病毒基因组同源性最高的病毒为日本海鳗小RNA病毒(CongerjaponicusCalicivirus)，同源性为38％，表明黄颡鱼小RNA病毒-1是一种全新的病毒，与已知小RNA病毒科中的其它任何病毒都不同。该病毒由专利技术人于2018年6月从黄颡鱼中分离所得，其基因组也由专利技术人首先获得，其基因组包含两个编码框，全长为7149bp。我国是黄颡鱼养殖大国，黄颡鱼病害发生率影响着广大鱼民的经济收入，近几年来，由于黄颡鱼病害的频发，已给广大养殖户造成了巨大的经济损失。黄颡鱼小RNA病毒-1在国内外未见报道，该病毒至今也未有检测试剂盒和检测方法报告，这严重阻碍了该病毒引起疾病的预警与预防工作，因此，对该病毒检测试剂盒的开发和检测技术的研究迫在眉睫。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述问题，提供了一种检测黄颡鱼小RNA病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒，本专利技术的引物、探针和试剂盒特异性强，敏感性高，能实现快速、有效且准确检测黄颡鱼小RNA病毒-1；本专利技术中的试剂盒为荧光定量检测试剂盒，该试剂盒在封闭的情况下判断结果，扩增产物不会对检测环境造成污染，可用于黄颡鱼小RNA病毒-1病的监测和早期预警与预防。本专利技术采用荧光定量技术，通过检测黄颡鱼小RNA病毒-1的衣壳蛋白基因，来检测黄颡鱼小RNA病毒-1，这是目前国内外首次研制的检测黄颡鱼小RNA病毒-1的试剂盒；该试剂盒的研制为黄颡鱼小RNA病毒-1病的监测和预防奠定基础。为了解决上述技术问题，本专利技术还公开了一种检测黄颡鱼小RNA病毒-1的引物探针混合物，其由引物组A和Taqman荧光探针B组成，探针B的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。进一步地，引物组A包含引物YCPRV-1-q85F和引物YCPRV-1-q85R；引物YCPRV-1-q85F的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；引物YCPRV-1-q85R的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；探针B的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。进一步地，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁3.5、花菁5和花菁5.5中的一种或几种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的一种或几种。本专利技术还公开了一种黄颡鱼小RNA病毒-1荧光定量检测试剂盒，包括特异性引物组A和Taqman荧光探针B。进一步地，Taqman荧光探针B核苷酸序列5’端标记HEX，3’端标记BHQ1。进一步地，该试剂盒还包括独立包装的病毒核酸提取液、一步法RT-qPCR反应液、阳性质控品、阴性质控品，其中病毒核酸提取液为为含有4mol/L异硫氰酸胍、0.5％十二烷基肌氨酸钠、40mmol/LDTT、25mmol/L柠檬酸钠、20μg糖原、pH8.0的缓冲液，一步法RT-qPCR反应液为探针法荧光定量一步法RT-qPCR反应液，阴性质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品是含有黄颡鱼小RNA病毒-1衣壳蛋白基因的载体。本专利技术还公开了一种由上述检测黄颡鱼小RNA病毒-1荧光定量检测试剂盒在检测黄颡鱼小RNA病毒-1中的应用，包括以下步骤：待检样品使用病毒核酸提取液提取病毒RNA，分别加入到引物探针混合液，再加入一步法RT-qPCR反应液，混匀后进行荧光定量PCR，反应条件为42℃20分钟，95℃条件下反应5-10分钟；然后95℃反应5-15秒，60℃反应20-40秒，共38-42个循环；荧光信号收集时设定为HEX，荧光信号收集设在60℃；结果判断：如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为黄颡鱼小RNA病毒-1阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，Ct值≤35，则黄颡鱼小RNA病毒-1别判定为阳性。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)采用本专利技术的引物组对黄颡鱼小RNA病毒-1进行检测，因为特异性高，所以可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；2)本专利技术的快速诊断试剂盒是利用荧光定量技术快速检测黄颡鱼小RNA病毒-1，检测灵敏度高，扩增模板仅需15.6个病毒拷贝；3)本专利技术的快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1h即可完成扩增，且效率高；4)本专利技术的快速诊断试剂盒操作简单，对检测人员的技术素质要求较低，可建立成本低廉的快速筛选体系，实现现场高通量快速检测；5)本专利技术的快速诊断试剂盒不但使得黄颡鱼小RNA病毒-1定性检测更加简便快速、特异性高、灵敏度高，而且该试剂盒是检测黄颡鱼小RNA病毒-1的第一个试剂盒，填补了黄颡鱼小RNA病毒-1无检测方法的缺口，具有很高的科研和经济价值。当然，实施本专利技术的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术黄颡鱼小RNA病毒-1荧光定量检测试剂盒特异性测试图；其中，1：嗜水气单胞菌；2：鲫鱼疱疹病毒病毒；3：鲤鱼浮肿病毒；4：黄颡鱼动脉炎病毒5：草鱼出血病病毒；6：锦鲤疱疹病毒；7：黄颡鱼小RNA病毒-1；NTC：正常黄颡鱼RNA阴性对照；图2是本专利技术黄颡鱼小RNA病毒-1荧光定量检测试剂盒灵敏度检测图；其中1-7分别代表1.56×106copies、1.56×105copies、1.56×104copies、1.56×103copies、1.56×102copies、1.56×101copies、1.56×100copies。具体实施方式以下将配合附图及实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。下述所用到的试剂和材料若非特殊说明均为本领域人员的公知常识。实施例1检测黄颡鱼小RNA病毒-1的引物探针混合物，其由引物组A和Taqman荧光探针B组成，探针B的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。该引物组A包含引物YCPRV-1-q85F和引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测黄颡鱼小RNA病毒-1的引物探针混合物，其特征在于，其由引物组A和Taqman荧光探针B组成，Taqman荧光探针B的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。/n

【技术特征摘要】
1.检测黄颡鱼小RNA病毒-1的引物探针混合物，其特征在于，其由引物组A和Taqman荧光探针B组成，Taqman荧光探针B的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。


2.根据权利要求1所述的引物探针混合物，其特征在于，所述引物组A包含引物YCPRV-1-q85F和引物YCPRV-1-q85R；
所述的引物YCPRV-1-q85F的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
所述的引物YCPRV-1-q85R的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
所述Taqman荧光探针B的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。


3.根据权利要求1所述的黄颡鱼小RNA病毒-1Taqman荧光探针B，其特征在于，所述荧光报告基团选自6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁3.5、花菁5和花菁5.5中的一种或几种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的一种或几种。


4.一种黄颡鱼小RNA病毒-1荧光定量检测试剂盒，其特征在于，包括特异性引物组A和Taqman荧光探针B。


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【专利技术属性】
技术研发人员：潘晓艺，蔺凌云，沈锦玉，姚嘉赟，尹文林，黄雷，袁雪梅，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33