一种检测牛结节性皮肤病的Cycleave荧光PCR方法技术

本发明专利技术提供一种Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法；所提供的引物对和探针，其中引物对的正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2；探针的序列为SEQ IDNO:3。本发明专利技术所提供的Cycleave荧光PCR检测牛结节性皮肤病病毒的引物、探针及方法具有检测灵敏度高、特异性好、高通量和操作简便的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种检测牛结节性皮肤病的Cycleave荧光PCR方法
本专利技术属牛病病原微生物检测
，具体涉及一种用于检测牛结节性皮肤病的Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法。
技术介绍
牛结节性皮肤病(Lumpyskindisease，LSD)是一种由痘病毒科(Poxviridae)、羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)的牛结节性皮肤病病毒(Lumpyskindiseasevirus，LSDV)引起的急性、亚急性传染病，主要特征是发热，皮肤、粘膜上结节样病变和淋巴结肿大等。牛是该病毒的特异性宿主，发病可导致奶牛产奶量下降、公牛短暂或永久不育、怀孕牛流产、皮革损坏以及继发细菌感染导致死亡。该病曾于非洲、中东、东欧等地区多个国家流行并造成巨大经济损失。检测时，通过发热、皮肤结节样变化、淋巴结肿大等临床症状可初步诊断该病，但其确诊需依赖实验室检测，特别是疾病处于潜伏期或前驱期时。而且患病牛产生皮肤损伤的症状易与皮肤癣病、昆虫叮咬等易混淆；发病期，患病牛结节处可呈现黏膜坏死、破溃等症状，需与口蹄疫、蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛传染性鼻气管炎等进行鉴别。此外，还存在无临床症状的隐性感染的情况，均需进行实验室检测确诊。因此，开发快速、准确、简便的LSD特异性检测方法是防控该病的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法，从而实现对牛结节性皮肤病病毒特异、敏感、快速的检测。本专利技术首先提供一种检测牛结节性皮肤病病毒的引物对和探针，引物对和探针序列信息如下：牛结节性皮肤病病毒检测正向引物LSDforward：5′-CGATACACTCTCCRATATC-3′(SEQIDNO:1)牛结节性皮肤病病毒检测反向引物LSDreverse：5′-AACGAGAAGTATGAATTAGC-3′(SEQIDNO:2)牛结节性皮肤病病毒检测探针LSDprobe：5′-GGCCGCC-3′(SEQIDNO:3)其中，检测探针LSDprobe的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团Eclipse标记，下划线位置为标记的RNA位点。上述引物和探针用于制备检测牛结节性皮肤病病毒的Cycleave荧光PCR检测体系。进一步，本专利技术还提供检测牛结节性皮肤病病毒核酸的Cycleave荧光PCR方法，包括如下的步骤：1)Cycleave荧光PCR反应体系配制反应液每管25μL，含有2×CycleavePCR反应液12.5μL，5pmol/μL的LSDforward和LSDreverse各0.6μL，5pmol/μL的LSDprobe0.8μL，双蒸水8.5μL，待检测样品DNA模板2μL。其中，CycleavePCR检测试剂盒(目录号：CY505A)购自宝生物工程(大连)有限公司产品。2)Cycleave荧光PCR反应体系扩增检测反应条件设置为：95℃预变性10s；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s(收集FAM信号)，共40个循环。3)结果判定阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。待检样品无Ct值并且无扩增曲线，结果判为阴性；待检样品Ct值≤40.0，且出现典型的扩增曲线，结果判为阳性。本专利技术所提供的Cycleave荧光PCR检测牛结节性皮肤病病毒的引物、探针及方法，具有如下的技术优点：1)灵敏度高：扩增模板的最低检出限可达1.13×100copies/μL，约合2copies/反应；2)特异性好：采用Cycling标记的荧光探针，特异性针对LSDV基因组产生荧光扩增信号，经验证对同属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒，及常见的口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、蓝舌病病毒等相关牛病病毒，均无交叉反应；3)快速高通量：检测速度快，加入样品后40分钟内即可完成整个扩增检测过程，且根据荧光定量PCR仪的检测孔数量，可以一次性实现96～384个样品的同步检测；4)操作简便：配置好的CycleavePCR反应体系，置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。附图说明图1：本专利技术扩增LSDVORF024基因部分序列的引物和探针设计示意图，其中引物探针设计区域由方框圈出。图2：阳性质粒制备电泳结果图，其中泳道1：2000bpMarker；泳道2：LSDV/China/XJ/2019-1。图3：CycleavePCR灵敏度试验结果图，其中1：工作标准品1；2：工作标准品2；3：工作标准品3；4：工作标准品4；5：工作标准品5；6：工作标准品6；7：工作标准品7；8：工作标准品8；9：工作标准品9；10：阴性对照。图4：CycleavePCR标准曲线结果图，其中1：工作标准品1；2：工作标准品2；3：工作标准品3；4：工作标准品4；5：工作标准品5；6：工作标准品6；7：工作标准品7；8：工作标准品8。图5：CycleavePCR特异性试验结果图，其中1：工作标准品4；2：绵羊痘病毒；3：山羊痘病毒；4：O型/A型口蹄疫病毒；5：牛病毒性腹泻-黏膜病病毒与传染性鼻气管炎病病毒；6：蓝舌病病毒；7：阴性对照。具体实施方式本专利技术采用的Cycleave荧光PCR是采用一对引物和一个嵌合有RNA位点的DNA探针扩增模板，当探针与互补的目标DNA杂交时，在RNA位点连接处切割探针，产生标记荧光，通过实时监测荧光信号实现检测目的。为了对本专利技术的技术特征、目的和效果有更清楚的理解，现对照附图详细说明本专利技术的具体实施方式。实施例1：引物及探针的筛选与设计牛结节性皮肤病病毒(Lumpyskindiseasevirus,LSDV)属于羊痘病毒属，同属还有山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GTPV)和绵羊痘病毒(Sheeppoxvirus,SPPV)，已有研究显示三种病毒间具有较高基因组同源性。为了避免检测LSDV时出现假阳性，首先，从NCBI数据库中查找并下载已有的全部27株LSDV基因组全序列(GenBank登录号：MN636843.1、MN636842.1、MN636841.1、MN636840.1、MN636839.1、MN636838.1、MK4418381、MH646674.1、KX764645.1、KX764644.1、KX764643.1、MT992618.1、MT130502.1、AF409137.1、MN995838.1、MN642592.1、MN072619.1、KX894508.1、MH893760.2、KY829023.3、KY829023.3、KY702007.1、KX683219.1、MT130502.2、MT643825.1、AF325528.1、AF409138.1)，已有全部12株GTPV基因组全序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测牛结节性皮肤病病毒的引物对和探针，其特征在于，所述的引物对，其正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2；探针的序列为SEQ ID NO:3。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测牛结节性皮肤病病毒的引物对和探针，其特征在于，所述的引物对，其正向引物的序列为SEQIDNO:1，反向引物的序列为SEQIDNO:2；探针的序列为SEQIDNO:3。


2.如权利要求1所述的引物对和探针，其特征在于，所述的探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团Eclipse标记。


3.权利要求1所述的引物对和探针在制备检测牛结节性皮肤病病毒的Cycleave荧光PCR检测制品中的应用。


4.一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的制品，其特征在于，所述的制品为Cycleave荧光PCR检测制品，其中包含有权利要求1所述的引物对和探针。


5.一种检测牛结节性皮肤病病毒的方法，其特征在于，所述的方法中使用权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：南文龙，陆游，陈义平，吴晓东，王永杰，哈达，特木尔巴根，巩明霞，李林，张永强，赵永刚，屈海龙，邹艳丽，张雨初，王志，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：山东;37