一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法技术

本发明专利技术属于蛋白质生物学研究技术领域，具体涉及研究蛋白相互作用的方法。本发明专利技术提供的基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法，将待研究的两个蛋白称作X和Y，将MS2噬菌体REP蛋白拆分成功能互补的2个片段REP‑a和REP‑b，使REP‑a与X融合，REP‑b与Y融合；构建质粒1，包含MS2噬菌体基因组，质粒1的REP编码区由REP‑a与X融合基因片段替换，无REP‑b基因片段；构建质粒2，表达REP‑b与Y融合片段；将质粒1表达的病毒样颗粒(VLPs)侵染含质粒2的MS2噬菌体宿主菌并检查是否有噬菌斑形成，如产生噬菌体斑则说明X与Y有相互作用。本发明专利技术提供的方法操作相对简单，结果易见。

【技术实现步骤摘要】
一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法
本专利技术属于蛋白质生物学研究
，具体涉及研究蛋白相互作用的方法。
技术介绍
蛋白质是生命活动的承担者，具有形成组织结构，信号转导，免疫保护及物质运输等功能。在体内，蛋白质几乎不单独行使功能，而是通过形成蛋白质复合物发挥作用。蛋白相互作用及其形成的作用网络，在许多生命活动中发挥重要作用，蛋白相互作用的研究在推断生物体内蛋白质功能方面具有重要作用，可以通过研究未知蛋白质与已知蛋白质的相互作用，推断未知蛋白质的功能。近年来，蛋白相互作用的数据及其网络结构正因许多高通量试验方法而被逐渐地证实和完善，这些高通量试验方法可分为三类：生物活体外试验，活体内试验和模拟生物学试验的生物学信息方法。因生物活体外试验更为简便，应用更为广泛，其包括：双向电泳技术，串联亲和纯化，GST-pulldown技术，BIAcore，蛋白碎片互补法，亲和色谱法，双分子荧光互补技术，免疫共沉淀，蛋白质微阵列法，X-光散技术，核磁共振法和噬菌体展示技术等。这些技术虽然促进蛋白相互作用的发展，但不可否认的是，他们虽都有优点却仍存在着很多不足之处，例如：双向电泳虽然灵敏度很高却常受到电泳缓冲溶液及其他一些环境因素的影响；串联亲和纯化检测则接近蛋白在生物体内的原始状态但却常受到标签的干扰而常常出错；GST-pulldown技术则展示其极高的特异性却无法对大规模的蛋白样品进行筛选甚至会因内源性蛋白而呈现假阳性并且该假阳性较难排除；BIAcore具有自动化却花费昂贵；蛋白碎片互补法可以鉴定整个蛋白家族中蛋白质间的相互作用，鉴定的蛋白质不论分子质量及表达量却被灵敏度及操作难度限制；亲和色谱法结果虽可靠准确却也常有假阳性；双分子荧光互补简单快速却常伴有假阳性和假阴性结果必须重复多次验证；免疫共沉淀一般适用于两个蛋白质之间的相互作用研究但无法达到大规模验证的要求；蛋白质微阵列技术能检测丰度较低及分子质量相对较小的蛋白质但是当需要检测大量样品时其需要探针太多且与靶蛋白结合的特异性很低；X-光散技术具有高分辨率且能观察到蛋白质相互作用时三维构象的变化但操作比较繁琐困难；核磁共振则能观察大分子及小分子的信号但是对环境却不太友好。而噬菌体展示技术拥有不同于其他方法的操作和应用，发展更为迅猛，2018年的诺贝尔化学奖更是颁给了在噬菌体展示技术方面做出重要贡献的两位科学家Winter和Smith。噬菌体展示技术的优越性体现在不仅灵敏度高，检测度高，而且成本低，更能进行高通量的筛选。在临床方面、新药,疫苗开发，抗体工程分离技术方面得到广泛应用。但该方法需要将候选蛋白固定填料上，操作较繁琐。大肠杆菌MS2噬菌体属于单链RNA噬菌体，基因组全长3659bp，由编码成熟酶蛋白(A蛋白)、衣壳蛋白(CP)、复制酶蛋白(REP)和裂解蛋白(Lys)等4种蛋白质分子的基因组成。A蛋白和CP蛋白与噬菌体颗粒形成相关，REP为RNA复制酶，与噬菌体基因组的复制相关，缺乏REP则噬菌体不能繁殖。
技术实现思路
本专利技术基于MS2噬菌体建立一个新的蛋白相互作用方法，操作相对简单，结果易见，是现有研究蛋白相互作用方法的有益补充。本专利技术基于MS2噬菌体开发的研究蛋白相互作用的新方法，其原理如下：将待研究的两个蛋白称作X和Y，将MS2噬菌体REP蛋白拆分成功能互补的2个片段REP-a和REP-b，使REP-a与X融合，REP-b与Y融合。构建质粒1，包含MS2噬菌体基因组，质粒1的REP编码区由REP-a与X融合基因片段替换，无REP-b基因片段；构建质粒2，表达REP-b与Y融合片段。将质粒1表达的病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)侵染含质粒2的MS2噬菌体宿主菌并检查是否有噬菌斑形成。如X与Y能相互作用，则会使REP-a与REP-b相互靠近。REP-a与REP-b这2个片段由于功能互补，相互靠近后具备完整的REP酶活性，则会产生噬菌体斑。如X与Y没有相互作用，单独的REP-a或REP-b不具备完整的REP活性，噬菌体不能繁殖，则不产生噬菌斑。本专利技术建立的一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法，将待检测相互作用的2个蛋白分别命名为X和Y，其特征在于：包括以下步骤：(1)将MS2噬菌体RNA复制酶REP蛋白拆分成功能互补的2个片段REP-a和REP-b；(2)构建质粒1，包含MS2噬菌体基因组，REP编码区由REP-a与X融合基因片段替换，无REP-b基因片段，也就是质粒1包含重组MS2噬菌体基因组；(3)表达步骤(2)中构建的质粒1，重组MS2噬菌体基因组中MS2噬菌体的A蛋白和CP蛋白的表达将转录后形成的重组MS2噬菌体基因组RNA包装后形成VLPs，纯化该VLPs；(4)构建质粒2，将REP-b片段基因与Y基因融合，能表达形成REP-b-Y的蛋白片段；(5)将质粒2转入MS2宿主菌中；MS2宿主菌可以选择XL1-Blue等；(6)将第(3)步纯化得到的VLPs侵染第(5)步含质粒2的MS噬菌体宿主菌，并检测噬菌斑。观察噬菌斑检测结果，如出现噬菌斑则说明X,Y蛋白有相互作用。具体的，在步骤(1)中，将MS2噬菌体RNA复制酶拆分成功能互补的2个片段，其使用的野生型MS2噬菌体的REP由545氨基酸组成，将前氨基端的53个氨基酸组成的片段作为REP-a，将第54氨基酸(Thr)到第545(Arg)氨基酸组成的蛋白片段作为REP-b，或者将前氨基端的384氨基酸组成的蛋白片段作为为REP-a，将第385氨基酸(Arg)到第545氨基酸(Arg)组成的蛋白片段为REP-b；具体的，在步骤(2)中，REP-a与X融合基因片段，在REP-a和X蛋白之间加入连接序列；具体的，上述REP-a和X蛋白之间加入连接序列为编码连接肽(SGGGG)n的序列，n的取值为1-3中的整数；具体的，步骤(4)中，REP-b与Y融合基因片段，在REP-b和Y蛋白之间加入连接序列；具体的，上述REP-b和Y蛋白之间加入连接序列为编码连接肽(SGGGG)n的序列，n的取值为1-3中的整数。附图说明图1为本专利技术建立的一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法的原理图；图2为本专利技术一具体实施例的实验结果图；图3为本专利技术另一具体实施例的实验结果图。具体实施方式为使本研究领域普通技术人员更好地理解本专利技术，以下结合具体实施例及附图对本专利技术进行进一步的说明，具体实施例不用于限制本专利技术。实施例一在本实施例中选取野生型MS2噬菌体(ATCC13076-B1，购自ATCC)作为实验材料，其基因序列在GenBank中可获取到，GenBank(NC_001417.2)，如SEQIDNO:1所示。1.将MS2噬菌体中REP蛋白拆分成能成功互补的2个片段REP-a和REP-b:野生型MS2噬菌体的REP为545氨基(GenBank:NC_001417.2中第1761-3398间DNA编本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法，将待检测相互作用的2个蛋白分别命名为X和Y，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)将MS2噬菌体RNA复制酶REP蛋白拆分成功能互补的2个片段REP-a和REP-b；/n(2)构建质粒1，包含MS2噬菌体基因组，REP编码区由REP-a与X融合基因片段替换，无REP-b基因片段，也就是质粒1包含重组MS2噬菌体基因组；/n(3)表达步骤(2)中构建的质粒1，重组MS2噬菌体基因组中MS2噬菌体的A蛋白和CP蛋白的表达将转录后形成的重组MS2噬菌体基因组RNA包装后形成VLPs，纯化该VLPs；/n(4)构建质粒2，将REP-b片段基因与Y基因融合，能表达形成REP-b-Y的蛋白片段；/n(5)将质粒2转入MS2宿主菌中；/n(6)将第(3)步纯化得到的VLPs侵染第(5)步含质粒2的MS噬菌体宿主菌，并检测噬菌斑，观察噬菌斑检测结果，如出现噬菌斑则说明X,Y蛋白有相互作用。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法，将待检测相互作用的2个蛋白分别命名为X和Y，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将MS2噬菌体RNA复制酶REP蛋白拆分成功能互补的2个片段REP-a和REP-b；
(2)构建质粒1，包含MS2噬菌体基因组，REP编码区由REP-a与X融合基因片段替换，无REP-b基因片段，也就是质粒1包含重组MS2噬菌体基因组；
(3)表达步骤(2)中构建的质粒1，重组MS2噬菌体基因组中MS2噬菌体的A蛋白和CP蛋白的表达将转录后形成的重组MS2噬菌体基因组RNA包装后形成VLPs，纯化该VLPs；
(4)构建质粒2，将REP-b片段基因与Y基因融合，能表达形成REP-b-Y的蛋白片段；
(5)将质粒2转入MS2宿主菌中；
(6)将第(3)步纯化得到的VLPs侵染第(5)步含质粒2的MS噬菌体宿主菌，并检测噬菌斑，观察噬菌斑检测结果，如出现噬菌斑则说明X,Y蛋白有相互作用。


2.如权利要求1所述的一种基于MS2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法，其特征在于：所述步骤(1)中，其使用的野生型MS2噬菌体的REP由545氨基酸组成，将前氨基端的53个氨基酸组成的片段作为REP-a，将第54氨基酸(Thr)到第545(Arg)氨基酸组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳永长，刘捷婧，林小容，陈敏，陈伟烙，
申请(专利权)人：广州医科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44