一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法技术

本发明专利技术提供一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法，试剂盒主要包括引物探针混合物，所述引物探针混合物由Orf1ab基因、N基因和S基因特异性的正、反向引物及特异性的探针组成，采用本发明专利技术中的试剂盒具有快速、灵敏度高、特异性好以及具有良好重现性的优点；本发明专利技术中的内质控品的引物序列中扩增片段为人基因组中基因，可增加判断采样是否成功的敏感性，能够避免检测结果假阴性，让潜在病患得到及时的隔离以及救治；研发人员在研发过程中偶然发现新型冠状病毒中的S基因具有很好的保守性，对于新型冠状病毒的检测具有很好的特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒检测试剂盒、用途及其使用方法
本专利技术属于基因检测领域，涉及一种利用多重实时荧光RT-PCR技术检测新型冠状病毒的试剂盒、用途及这种试剂盒的使用方法。
技术介绍
冬季和早春为流行性感冒的爆发季节，每年这个时候成人中的普通感冒主要由冠状病毒所引起。冠状病毒是在动物和人体中发现的一个大型病毒家族，最早由鸡胚中分离出来，到目前为止，大约有15中不同的冠状病毒被发现。其中，能感染人的冠状病毒有六种，HCoV-229E，HCoV-0C43，HCoV-NL63，HCoV-HKU1，SARS-CoV和MERS-CoV。在这6中病毒里，前四种只会引起普通的感冒，普通的病毒性感冒2-5天即会出现相应症状，经过治疗1-2周可以恢复。后两种是引起全球恐惧的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)MERS-CoV，这两种病毒可引起全球范围内大范围的流行。2019新型冠状病毒的序列已先后被中国疾控中心以及世界卫生健康组织WTO先后公布，新型冠状病毒和其他冠状病毒一样是一种ssRNA病毒，测序结果显示，其全长约30Kb，新型冠状病毒属于RNA病毒，现在针对该病毒的研究刚刚开始，现目前，多数厂家都是采用两个区域进行检测，但是，在实际检测中，存在一定比例单个靶标区域阳性的结果，说明试剂对不同区域的敏感性存在差异，也可能是靶标之间的相互竞争所导致，此外，试剂盒的其他成分、反应体系以及样本的加入量都会影响检测分析敏感性、特异性以及检测重现性。目前，大多数检测试剂盒里面都有内质控品，这些质控品都是取样后直接向样本中添加，内质控品只能检测整个提取以及检测过程操作是否正确，但是却不能保证采样过程是否成功，而样本采集的是否成功关乎患者检测结果，采样量的多少又与样本能够成功检测息息相关。使用外源内标进行检测会导致大量的潜在的冠状病毒因取样失败漏检，患者得不到及时的隔离以及救治，最终导致病人的死亡以及健康者的传染。因此，开发一种检测快速、灵敏度高、特异性好、能够避免假阴性以及具有良好重现性的新型冠状病毒检测试剂盒。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种快速、灵敏度高、特异性好、能够避免假阴性以及具有良好重现性的检测新型冠状病毒的RT-PCR检测试剂盒。本专利技术提供了一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述试剂盒主要包括引物探针混合物，所述引物探针混合物由Orf1ab基因、N基因和S基因特异性的正、反向引物及特异性的探针组成。进一步的，本专利技术中Orf1ab基因的正向引物的序列如SEQIDNO：1所示；所述Orf1ab基因的反向引物的序列如SEQIDNO：2所示；本专利技术中N基因的的正向引物的序列如SEQIDNO：3所示；所述N基因的反向引物的序列如SEQIDNO：4所示；本专利技术中S基因的正向引物的序列如SEQIDNO：5所示；所述S基因的反向引物的序列如SEQIDNO：6所示。进一步的，本专利技术中Orf1ab基因的探针的序列如SEQIDNO：7所示；本专利技术中N基因的探针的序列如SEQIDNO：8所示；本专利技术中S基因的探针的序列如SEQIDNO：9所示。进一步的，本专利技术试剂盒中还包括内质控品，所述内质控品的正向引物的序列如SEQIDNO：10所示，所述内质控品的反向引物的序列如SEQIDNO：11所示。进一步的，本专利技术中内质控品的探针序列如SEQIDNO：12所示。进一步的，本专利技术中探针的两端分别带有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团为FAM、ROX、VIC、TET和CY5中的一种，所述猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGBNFQ中的一种。进一步的，本专利技术试剂盒还包括PCR反应液，所述反应液主要由如下组分组成：Tris-HClpH＝8.51-10mM，KCl1-5mM，MgCl26-12mM，dATP0.5-2mM，dCTP0.5-2mM，dGTP0.5-2mM，dUTP2-4mM，DTT1-5mM。进一步的，本专利技术中PCR反应液主要由如下成分组成：Tris-HClpH＝8.55mM，KCl4mM，MgCl28mM，dATP0.8mM，dCTP0.8mM，dGTP0.8mM，dUTP2mM，DTT2mM。进一步的，本专利技术试剂盒还包括PCR酶液，PCR酶液主要由如下成分组成：HotStartTaq10-50％，UNG1-20％，HiScriptReverseTranscriptase1％-10％，TaqSSB10-50％，甘油10-50％，Anti-Taq1-50％。进一步的，本专利技术试剂盒中PCR酶液主要由如下成分组成：HotStartTaq15％；Anti-Taq15％；UNG7％；HiScriptReverseTranscriptase8％；TaqSSB15％；甘油40％。本专利技术还提供采用如上任意一项所述的试剂盒来检测新冠状病毒的用途。本专利技术还提供使用如上任意一项所述的试剂盒的使用方法，所述方法包括如下步骤：1)核酸提取：采用核酸提取试剂对样本中的RNA进行提取，得核酸提取产物；2)PCR扩增：PCR反应体系如下：PCR反应液10-50％；PCR酶液5-20％；单基因和内质控品的正向引物和反向引物分别0.1-4μM；探针0.05-0.8μM；核酸提取产物10-50％。进一步的，本专利技术中PCR反应体系如下：PCR反应液25％；PCR酶液10％；单项目和内质控品的正向引物和反向引物分别0.8μM；探针0.5μM；核酸提取产物30％。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：采用本专利技术中的试剂盒，通过试剂盒中的引物探针、PCR反应液、PCR酶液以及其他成分的结合、协同，最后得到一种快速、灵敏度高、特异性好以及具有良好重现性的检测新型冠状病毒的RT-PCR检测试剂盒；本专利技术中的内质控品为人基因组中的基因，不需要另外添加，样本中即含有，针对这个反应体系，我们设置了特异性的内质控品的引物和探针，能够增加判断采样是否成功的敏感性，能够避免检测结果假阴性，让潜在病患得到及时的隔离以及救治；研发人员在研发过程中偶然发现新型冠状病毒中的S基因具有很好的保守性，对于新型冠状病毒的检测具有很好的特异性。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再做进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术属于本专利技术的内容。附图说明图1为本专利技术试剂盒对不同浓度样本中N基因的扩增图；图2为本专利技术试剂盒对不同浓度样本中Orf1ab基因的扩增图；图3为本专利技术试剂盒对不同浓度样本中S基因的扩增图；图4为为本专利技术试剂盒特异性扩增图；图5为本专利技术试剂盒对除新冠病毒外的病原体中N基因的扩增图；图6为本专利技术试剂盒对除新冠病毒外的病原体中Orf1ab基因的扩增图；图7为本专利技术试剂盒对除新冠病毒外的病原体中S基因的扩增图。具体实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒主要包括引物探针混合物，所述引物探针混合物由Orf1ab基因、N基因和S基因特异性的正、反向引物及特异性的探针组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒主要包括引物探针混合物，所述引物探针混合物由Orf1ab基因、N基因和S基因特异性的正、反向引物及特异性的探针组成。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述Orf1ab基因的正向引物的序列如SEQIDNO：1所示；所述Orf1ab基因的反向引物的序列如SEQIDNO：2所示；
所述N基因的的正向引物的序列如SEQIDNO：3所示；所述N基因的反向引物的序列如SEQIDNO：4所示；
所述S基因的正向引物的序列如SEQIDNO：5所示；所述S基因的反向引物的序列如SEQIDNO：6所示。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：
所述Orf1ab基因的探针的序列如SEQIDNO：7所示；
所述N基因的探针的序列如SEQIDNO：8所示；
所述S基因的探针的序列如SEQIDNO：9所示；


4.如权利要求1-3任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括内质控品，所述内质控品的正向引物的序列如SEQIDNO：10所示，所述内质控品的反向引物的序列如SEQIDNO：11所示，优选的，所述内质控品的探针序列如SEQIDNO：12所示，


5.如权利要求1-4任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的两端分别带有荧光基团和猝灭基团，所述荧光基团为FAM、ROX、VIC、TET和CY5中的一种，所述猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3和MGBNFQ中的一种。


6.如权利要求1-5任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR反应液，所述反应液主要由如下组分组成：Tris-HClpH＝8.51-10mM，KCl1-5mM，MgCl2...

【专利技术属性】
技术研发人员：董璐，陈威，汪瑶，
申请(专利权)人：重庆中元汇吉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50