用于定性检测牛疱疹病毒I型的试剂和方法技术

本发明专利技术提供用于特异性检测牛疱疹病毒I型(BoHV1)的LAMP引物组，包含该引物组以用于通过LAMP扩增技术检测BoHV1病毒的试剂盒，以及使用该引物组或试剂盒通过LAMP扩增技术进行BoHV1检测的方法。通过本发明专利技术，可以实现在采样后40‑60分钟即完成快速检测，极大地提高了BoHV1检测的效率，并且通过肉眼观察即可判定检测结果。

【技术实现步骤摘要】
用于定性检测牛疱疹病毒I型的试剂和方法
本专利技术涉及牛疱疹病毒检测领域，具体地涉及一种用于定性检测牛疱疹病毒I型核酸的引物组、试剂盒及其方法。
技术介绍
牛疱疹病毒I型(BoHV1)可以引起家养牛和野牛患上传染性牛鼻气管炎(IBR)，该病毒分布于世界各地，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告的动物疫病，在中华人民共和国农业部公告第1125号发布的《一、二、三类动物疫病病种名录》中被列为二类动物疫病，即指可能造成重大经济损失，需要采取严格控制、扑灭等措施，防止扩散的疫病。因此快速、方便地检测BoHV1将有效阻止BoHV1的传播。目前对BoHV1核酸检测的方法通常为实时荧光定量PCR方法，这是检测BoHV1的传统方法，但是该方法需要昂贵的荧光定量PCR仪，需要专业人员进行繁琐的操作过程，并且上机检测的时间至少为1小时以上。因此，需要一种针对BoHV1核酸的高效、廉价且具有特异性的定性检测技术，其不依赖于昂贵PCR设备，能够在采样后40至60分钟内快速完成现场检测，并且肉眼观察即可判定检测结果，由此能够在牧场、基层检验中心等实验条件相对简单的地方完成BoHV1的快速检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种针对BoHV1核酸的高效、廉价且具有特异性的定性检测技术。本专利技术将可视染料和环介导等温扩增技术(LAMP)相融合，以BoHV1的gC基因特异性位点为目标基因，在对大量参考序列进行分析比对后，设计和筛选了一组特异性LAMP引物，通过LAMP技术来对其进行扩增，采用BLAST软件进行比对。结果表明，引物序列和数据库中的BoHV1病毒对应的序列吻合，与其他病毒序列无明显交叉，因此实现了特异性针对BoHV1的核酸定性检测，由此完成了本专利技术。因此，在第一方面，本专利技术提供了用于通过LAMP扩增反应检测牛疱疹病毒I型的引物组，所述引物组包括：BoHV1-F3：CAGCTTGAGCTTCTCCACG(SEQIDNO:1)；BoHV1-B3：CTGGGCGTACATCTCGGA(SEQIDNO:2)；BoHV1-FIP：GCCAAAACCGCTTTCAGAAGCA-CATGTCCAGGGAAACCACG(SEQIDNO:3)；BoHV1-BIP：GCGTCGAAGACGCGGAAGA-CTCACGGCCGTCTACGA(SEQIDNO:4)。在第二方面，本专利技术提供了一种用于通过LAMP扩增反应检测牛疱疹病毒I型的试剂盒，所述试剂盒包括：-包含第一方面所述的引物组。在第三方面，本专利技术提供了用于通过LAMP扩增反应检测牛疱疹病毒I型的方法，包括以下步骤：(1)从待测样品中获得DNA；(2)以所述DNA为模板，使用第一方面所述的引物组、或者第二方面所述的试剂盒来进行LAMP扩增反应；(3)对所述LAMP扩增反应的结果进行判断。本专利技术的有益之处在于：本专利技术提供一种高效、简便、且廉价的BoHV1定性检测技术。更具体地，本专利技术的检测方法为全封闭反应，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性；本专利技术的方法检测快速，操作简单，能够在采样后40至60分钟内快速完成现场检测，大大缩短了检测时间；并且，本专利技术的方法对BoHV1的检测不依赖于昂贵PCR设备，并且能够通过肉眼观察判定检测结果，不仅节约了仪器成本，而且能够广泛推广应用于牧场、基层检验中心等实验条件相对简单的地方。附图说明得益于以下具体实施方式以及参考附图，本专利技术的技术方案和益处对本领域技术人员会变得显而易见。图1示出根据本专利技术的一个具体实施方案的采用本专利技术的引物组以及羟基萘酚蓝(HNB)作为反应可视化指示剂得到的LAMP检测结果。图2示出根据本专利技术的一个具体实施方案的采用本专利技术的引物组对LAMP反应体系进行优化得到的LAMP检测结果。图3示出根据本专利技术的一个具体实施方案的采用本专利技术的4条特异性引物(F3、B3、FIP和BIP)得到的LAMP检测结果，其中图3A是LAMP扩增反应进行40分钟之后的结果，图3B是LAMP扩增反应进行60分钟之后的结果，其中+表示阳性，-表示阴性。图4示出根据本专利技术的一个具体实施方案的采用本专利技术的6条特异性引物(F3、B3、FIP、BIP、LF和LB)得到的LAMP检测结果，其中+表示阳性，-表示阴性。图5示出根据本专利技术的一个具体实施方案的采用本专利技术的引物组进行LAMP检测的特异性测试结果。图6示出根据本专利技术的一个具体实施方案的采用本专利技术的引物组进行LAMP检测的灵敏度测试结果。图7示出通过荧光定量PCR和本专利技术LAMP法检测牛疱疹病毒I型的灵敏度比较。具体实施方式下面对本专利技术进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本专利技术进行说明，而无意于对本专利技术的范围进行限制，本专利技术的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本专利技术的精神和主旨的情况下，可以对本专利技术的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。如上所述，本领域需要一种针对BoHV1核酸的高效、廉价且具有特异性的定性检测技术。本专利技术人在对大量参考序列进行分析比对后，以BoHV1的gC基因特异性位点为目标基因，设计和筛选了一组特异性LAMP引物组，通过LAMP检测技术来对其进行扩增，从而实现了针对牛疱疹病毒Ⅰ型核酸的定性快速检测，由此完成了本专利技术。如本领域技术人员所知晓的那样，LAMP检测技术是最近十年以来新建立的一种新的核酸等温扩增技术，已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫等病原菌的检测研究。LAMP技术采用特异性识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简单快捷并且成本低廉等优点。因此，在第一方面，本专利技术提供了用于通过LAMP扩增反应检测牛疱疹病毒I型(BoHV1)的引物组，所述引物组包括：BoHV1-F3：CAGCTTGAGCTTCTCCACG(SEQIDNO:1)；BoHV1-B3：CTGGGCGTACATCTCGGA(SEQIDNO:2)；BoHV1-FIP：GCCAAAACCGCTTTCAGAAGCA-CATGTCCAGGGAAACCACG(SEQIDNO:3)；BoHV1-BIP：GCGTCGAAGACGCGGAAGA-CTCACGGCCGTCTACGA(SEQIDNO:4)。本专利技术的引物序列可以通过本领域技术人员熟知的方法合成得到，并无特别限定。在一个具体的实施方案中，所述引物组还包括：BoHV1-LF：GAGCAAGGTGAAGATTAACGG(SEQIDNO:5)；BoHV1-LB：TTAGCTTCCCGTAGCCGTC(SEQIDNO:6)。本领域技术人员知晓，在LAMP技术中，通过额外增加一对环引物可以进一步提高LAMP反应的扩增效率。本领域技术人本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于通过LAMP扩增反应检测牛疱疹病毒1型(BoHV1)的引物组，所述引物组包括：/nBoHV1-F3：CAGCTTGAGCTTCTCCACG(SEQ ID NO:1)；/nBoHV1-B3：CTGGGCGTACATCTCGGA(SEQ ID NO:2)；/nBoHV1-FIP：GCCAAAACCGCTTTCAGAAGCA-CATGTCCAGGGAAACCACG(SEQ ID NO:3)；/nBoHV1-BIP：GCGTCGAAGACGCGGAAGA-CTCACGGCCGTCTACGA(SEQ ID NO:4)。/n

【技术特征摘要】
1.用于通过LAMP扩增反应检测牛疱疹病毒1型(BoHV1)的引物组，所述引物组包括：
BoHV1-F3：CAGCTTGAGCTTCTCCACG(SEQIDNO:1)；
BoHV1-B3：CTGGGCGTACATCTCGGA(SEQIDNO:2)；
BoHV1-FIP：GCCAAAACCGCTTTCAGAAGCA-CATGTCCAGGGAAACCACG(SEQIDNO:3)；
BoHV1-BIP：GCGTCGAAGACGCGGAAGA-CTCACGGCCGTCTACGA(SEQIDNO:4)。


2.根据权利要求1所述的引物组，其中所述引物组还包括：
BoHV1-LF：GAGCAAGGTGAAGATTAACGG(SEQIDNO:5)；
BoHV1-LB：TTAGCTTCCCGTAGCCGTC(SEQIDNO:6)。


3.一种用于通过LAMP扩增反应检测牛疱疹病毒1型的试剂盒，所述试剂盒包括：
-包含权利要求1或2所述的引物组。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：
-镁离子；
-脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，包括：脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟嘌呤三磷酸(dGTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)；
-链置换型DNA聚合酶，如BstDNA聚合酶；
-链置换型DNA聚合酶缓冲液。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括：
-反应可视化指示剂，如羟基萘酚蓝、PicoGreen、SYBRGreenI、或钙黄绿素，优选羟基萘酚...

【专利技术属性】
技术研发人员：周巧妮，许嘉婉，周晨，刘金华，郑志慧，朱宏基，
申请(专利权)人：深圳市易瑞生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44