一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合制造技术

本发明专利技术公开了一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO：3到6所示的引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO：10到11所示的探针。基于本引物和探针的组合，本发明专利技术建立了一种基于纳米粒子PCR技术检测新冠病毒N基因N501Y突变点和N基因D614G突变点的检测方法，具有扩增效率更高和特异性佳的特点，该方法的灵敏度高达5copies/反应，且对8种冠状病毒和N501Y和D614未突变株的SARS‑CoV‑2均表现出优良的特异性。说明该体系可以快速有效的进行新型冠状病毒突变株和未突变株的筛查。

【技术实现步骤摘要】
一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合
本专利技术涉及病毒检测
，具体地，涉及一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合。
技术介绍
冠状病毒是一个大型病毒家族，是目前人类已知的RNA病毒中基因组最大的病毒。新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎，COVID-19)为2019年新发急性呼吸道传染病，是之前未在人体中发现的冠状病毒新毒株，2020年2月11日，国际病毒分类委员会(ICTV)将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2。该病毒属于β冠状病毒，与冠状病毒SARS具有很强的同源性，但传播能力强于SARS。SARS-CoV-2可以引起新型冠状病毒肺炎，该病毒潜伏期长，传染性强，可导致严重急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克，多功能衰竭甚至死亡。2020年12月14日，英国向世界卫生组织报告了一种新的B.1.1.7谱系新冠病毒变异病株，英国称为“VUI202012/01”(VariantUnderInvestigation，year2020，month12，variant01)，即2020年12月调查的第一号变异毒株。《科学》杂志刊文称，这种新变种比原始毒株的传播性高出40～70％。回顾性研究表明，2020年9月20日在英格兰东南部的肯特郡就已经出现了首例由该变异病毒感染的病例。直至2020年12月中旬，伦敦超过60％的新冠感染病例都来自变异病毒。至此，该变异病毒已传播至英国各地，主要集中在伦敦、东南部和英格兰东部。除英国外，澳大利亚、丹麦、意大利、冰岛与荷兰、中国等国也接连发现了该变异病毒。与此同时，南非在2020年12月中下旬也发现另一种高传染率的SARS-CoV-2变种病毒(被命名为501Y.V2)。南非卫生部长表示，这种被命名为501Y.V2的病毒变种可能是引发南非第二波新冠迅猛疫情的原因。数据显示，南非高达90％的新增病例都是来自该变异病毒株。目前除南非外，已经有包括中国在内的多个国家出现了501Y.V2的感染者。SARS-CoV-2病毒通常以每个月1～2个突变的速度积累突变。这意味着，直至2020年12月所测的病毒与最开始测定的病毒基因组相差约20个位点，然而，B.1.1.7谱系变异病毒几乎同时出现23个位点的大量突变，进化之快前所未有。根据美国疾控中心(CDC)报道，B.1.1.7谱系病毒株发生23个特殊突变，包括14个非同义突变、6个同义突变和3个删除，其中，刺突蛋白(Spike蛋白)上同时出现的突变主要包含N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、HV69-70del、Y144del。而南非的501Y.V2突变株与英国的B.1.1.7谱系突变株具有相同的N501Y和D614G突变外，还包含了Spike蛋白E484K和K417N两个关键位点的突变。Spike蛋白与人类受体血管紧张素转换酶2(ACE2)的结合片段为residues:336-516。其中，突变N501Y是受体结合域(RBD)中的六个关键接触残基之一，刺突蛋白RBD区域的N501突变可以降低RBD关键残基的极性，从而提高新冠病毒与人体细胞表面ACE2受体的亲和力。中国专利202010312576.7一种基于RT-LAMP技术检测新冠病毒用引物组及检测试剂盒、202010358418.5一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物、试剂盒、检测方法及应用、CN202011428690.2一种用于检测新冠病毒的基因保守序列、引物探针组合、试剂盒及应用等都公开了在核酸水平上的信管病毒的检测方法，但是都无法将特定突变毒株与普通新冠病毒进行区分。目前，这类高传染率的新型冠状病毒突变毒株只能是通过基因组测序的方法与普通新冠病毒进行区分，过长的测序周期以及上万美元的仪器成本，阻碍了该病毒的检测效率。因此，一种能够有效鉴别高传染率新型冠状病毒与普通型新型冠状病毒的产品是目前亟需的。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合。本专利技术的第一个目的是提供一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合本专利技术的第二个目的是提供任一所述的引物和探针的组合早制备检测新冠病毒突变菌株的检测试剂盒中的应用。本专利技术的第三个目的是提供一种检测新冠病毒突变菌株的检测试剂盒。本专利技术的第四个目的是提供一种新型冠状病毒2019-nCoV的非诊断目的的检测方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：本专利技术提供的一组基于纳米粒子PCR技术检测超高传染率新型突变株的引物组，包括检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的ORF1ab基因的保守序列，N基因N501Y突变点、N基因D614G突变点，以及人基因RP-30。本专利技术以ORF1ab保守序列及人类基因RP-30作为双内参，RP-30基因作为采样监控，而ORF1ab保守序列作为冠状病毒的监控，双内参保证结果更准确。并通过对ORF1ab保守序列、N基因N501Y突变点、N基因D614G突变点的引物探针的优化，得到扩增效率更高和特异性佳的引物对。因此本专利技术要求保护一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合，含有核苷酸序列如SEQIDNO：3到6所示的引物，以及核苷酸序列如SEQIDNO：10到11所示的探针。优选地，SEQIDNO：11所示的探针的5’端第三个碱基有LNA修饰。更优选地，还含有核苷酸序列如SEQIDNO：1到2所示的引物，以及核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的探针。更优选地，还含有核苷酸序列如SEQIDNO：7到8所示的引物，以及核苷酸序列如SEQIDNO：12所示的探针。进一步优选地，各探针的3’端有猝灭荧光基团。进一步更优选地，所述猝灭荧光基团为BHQ2。进一步优选地，各探针的5’端有不同的激发荧光基团进一步更优选地，所述激发荧光基团为VIC、ROX、FAM、和Cy5的一种或几种。再进一步优选地，在各引物和/或探针的5’端分别修饰有巯基，通过巯基自组装有硫化铋纳米颗粒。优选地，5’端带有SH(巯基)修饰引物和/或探针，分别与硫化铋纳米颗粒溶液、柠檬酸缓冲液混合均匀，孵育，实现巯基化寡核苷酸在硫化铋纳米颗粒表面的自组装。任一所述的引物和探针的组合早制备检测新冠病毒突变菌株的检测试剂盒中的应用。本专利技术要求保护一种检测新冠病毒突变菌株的检测试剂盒，含有任一所述的引物和探针的组合。优选地，所述检测试剂盒基于纳米粒子PCR技术，含有所述的引物和探针的组合。本专利技术还要求保护一种新型冠状病毒2019-nCoV的非诊断目的的检测方法，使用任一所述的引物和探针的组合。优选地，利用纳米粒子PCR技术。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术建立了一种基于纳米粒子PCR技术检测新冠病毒N基因N501Y突变点和N基因D614G突变点的检测方法，具有扩增效率更高和特异性佳的特点，该方法的灵敏度高达5copies/反应，且对8种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQ ID NO：3到6所示的引物，以及核苷酸序列如SEQ ID NO：10到11所示的探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测新冠病毒的突变毒株的引物和探针的组合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQIDNO：3到6所示的引物，以及核苷酸序列如SEQIDNO：10到11所示的探针。


2.根据权利要求1所述的引物和探针的组合，其特征在于，SEQIDNO：11所示的探针的5’端第三个碱基有LNA修饰。


3.根据权利要求1或2所述的引物和探针的组合，其特征在于，还含有核苷酸序列如SEQIDNO：1到2所示的引物，以及核苷酸序列如SEQIDNO：9所示的探针。


4.根据权利要求1或2所述的引物和探针的组合，其特征在于，还含有核苷酸序列如SEQIDNO：7到8所示的引物，以及核苷酸序列如SEQIDNO：12所示的探针。


5.根据权利要求1到4任一所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖彩霞，袁巧梅，王涛，
申请(专利权)人：广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44