胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒，包括用于检测4种miRNA标志物的PCR引物，所述的4种miRNA标志物分别为miRNA

【技术实现步骤摘要】
胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒


[0001]本专利技术涉及纳米生物检测
，具体涉及一种胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒。

技术介绍

[0002]肿瘤普遍存在耐药现象，其是肿瘤临床化疗失败和复发的主要原因之一，即使使用分子靶向药物几个月后也会产生耐药，导致疗效降低或无效，这成为临床上最棘手的问题之一。数据显示，大约30％～80％的肿瘤细胞在化疗期间产生耐药性。
[0003]胃癌是常见的恶性肿瘤。手术后进行常规的化疗是治疗的一个必经过程。但是，胃癌患者由于胃癌的类型不同，可能存在对常用的化疗药物耐药，如果快速明确胃癌患者是否对化疗药物耐药，具有巨大的临床需求。化疗药物如顺铂，阿霉素，紫杉醇是常规用于胃癌治疗的药物。如何判断化疗药物是否耐药，胃癌治疗是否存在复发，判断预后，具有现实的临床需求。
[0004]循环系统miRNA作为肿瘤诊断标志物的研究越来越广泛，而这些miRNA也被包裹于外泌体中。在胃癌发展的机理上，外泌体的促癌机制多种多样，如外泌体可促进胃癌转移前肿瘤微环境的形成，包括免疫抑制、基质重塑、血管生成和上皮
‑
间充质转化(Epithelial
‑
mesenchymal transition,EMT)。通过外泌体传导促癌分子(尤其miRNA之类的小分子)，是胃癌发生耐药、转移等进展的重要机理，也构成了治疗的潜在靶点。鉴于miRNA在人类疾病中的重要作用，迫切需要研发敏锐的miRNA检测方法，应用于疾病的诊断、治疗以及预后。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒，包括用于检测4种miRNA标志物的PCR引物，所述的4种miRNA标志物分别为miRNA
‑
23b、miR
‑
21
‑
3p、miR
‑
223和miR
‑
146b
‑
5p。
[0007]胃癌患者血浆外泌体中miRNA
‑
23b的表达水平与胃癌的复发及预后密切相关，外泌体中miR
‑
21
‑
3p高表达赋予胃癌细胞顺铂耐药性，外泌体中miR
‑
223高表达赋予胃癌细胞阿霉素的化疗耐药性。miR 146b
‑
5p与早期胃癌的肿瘤浸润深度呈正相关，与紫杉醇耐药相关，与转移预后相关。4个miRNA标志物的同步检测，可以判断胃癌患者是否存在顺铂、阿霉素、紫杉醇耐药，是否存在复发与转移的预后。
[0008]优选地，所述的miRNA
‑
23b的PCR引物如下：
[0009]F(也称正向引物或上游引物):GGGTTCCTGGCATGCTGATT，
[0010]R(也称反向引物或下游引物):TCGTGGTTGCGTGGTAATCC。
[0011]优选地，所述的miR
‑
21
‑
3p的PCR引物如下：
[0012]F:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGCCCA，
[0013]R:ACACTCCAGCTGGGCAACACCAGTCGATG。
[0014]优选地，所述的miR
‑
223的PCR引物如下：
[0015]F:CCACGCTCCGTGTATTTGAC，
[0016]R:CCGCACTTGGGGTATTTGAC。
[0017]优选地，所述的miR
‑
146b
‑
5p的PCR引物如下：
[0018]F:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGCCTAT，
[0019]R:ACACTCCAGCTGGGTGAGAACTGAATTCCAT。
[0020]优选地，所述的胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒，还包括用于标记反向引物的荧光磁性纳米粒子编码微球。
[0021]进一步优选地，所述的荧光磁性纳米粒子编码微球利用反向微乳法制备得到。
[0022]进一步优选地，所述的荧光磁性纳米粒子编码微球用去离子水进行稀释，浓度为100μg/ml。在本专利技术中，利用反向微乳法制备荧光磁性纳米粒子编码微球，采用电镜进行表征，微球直径为：20
‑
30nm，制备后，用去离子水进行稀释，浓度为100μg/ml。
[0023]优选地，所述的胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒，还包括PCR buffer，反转录酶，Taq酶和dNTP混合液。
[0024]优选地，所述的胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒，以GAPDH作为内对照。
[0025]一种上述胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0026]采集胃癌患者2mL外周血，采用超速离心分离纯化血清外泌体，分离后的血清外泌体
‑
80℃保存备用。
[0027]采用磁性纳米粒子基础上的核酸提取试剂盒，提取血清外泌体中的总RNA，用NanoDrop ND
‑
1000检测RNA浓度和纯度，用DEPC处理的双蒸水稀释总RNA，保持浓度为100μg/ml，4℃保存备用。
[0028]利用编码微球与反向引物通过碱基配对结合在一起，实现荧光磁性纳米粒子编码微球标记反向引物。
[0029]取4个PCR管，分别标记上1
‑
4，对应4个miRNA标志物(miRNA
‑
23b，miR
‑
21
‑
3p，miR
‑
223，miR
‑
146b
‑
5)，每管50μl反应液的制备如下：PCR buffer 10μL，反转录酶1μL，Taq酶1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTP混合液15μL，RNA样品5μL，荧光磁性纳米粒子编码微球2μL，13μL去离子水，以GAPDH 1μL作为内对照，混匀后，放入定量PCR仪进行扩增。
[0030]PCR反应条件：37℃反转录15分钟，95℃反应30秒；然后，PCR反应条件：95℃反应5秒，60℃反应15秒，72℃反应30秒，35个循环。
[0031]PCR反应产物，利用NanoDrop进行定量检测。
[0032]进一步优选地，血清外泌体的制备方法包括：收集患者外周血2ml，采用超速离心分离纯化血清外泌体。经超高速离心并裂解，500μL无细胞血清样本在冰上融化，用3mL PBS稀释，0.22μm滤膜过滤，150000g离心力下，4℃离心过夜。弃去上清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒，其特征在于，包括用于检测4种miRNA标志物的PCR引物，所述的4种miRNA标志物分别为miRNA
‑
23b、miR
‑
21
‑
3p、miR
‑
223和miR
‑
146b
‑
5p。2.根据权利要求1所述的胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒，其特征在于，所述的miRNA
‑
23b的PCR引物如下：F:GGGTTCCTGGCATGCTGATT，R:TCGTGGTTGCGTGGTAATCC。3.根据权利要求1所述的胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒，其特征在于，所述的miR
‑
21
‑
3p的PCR引物如下：F:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGCCCA，R:ACACTCCAGCTGGGCAACACCAGTCGATG。4.根据权利要求1所述的胃癌治疗耐药与复发预后的miRNA检测PCR试剂盒，其特征在于，所述的miR
‑
223的PCR引物如下：F:CCACGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，刘彬，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：