一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及基因突变检测领域，公开了一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂和对照品。所述核酸扩增试剂包括RET M918T反应液，所述反应液中含有用于检测RET基因M918T突变的特异性引物和荧光探针。所述核酸扩增试剂还包括ddPCR Mix。本发明专利技术还公开了上述检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒的检测方法的检测方法。本申请的试剂盒采用数字PCR技术，可对甲状腺结节细针穿刺活检样本中的RET基因M918T突变进行定量检测，从而辅助诊断甲状腺结节的良恶性。甲状腺结节的良恶性。甲状腺结节的良恶性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及基因突变检测领域，具体是一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]RET原癌基因编码一种具有络氨酸激酶活性的单次跨膜糖蛋白受体，作用与神经胶质细胞胞外信号分子。多种肿瘤的发生发展与RET基因异常激活密切相关。其中,RET基因点突变M918T髓质甲状腺癌(MTC)中最常见的突变类型。M918T突变可能导致耐药性，尤其是对血管内皮生长因子抑制剂莫特沙尼的耐药性。并且，RETM918T可能导致更具侵袭性的MTC，预后较差。
[0003]RET基因M918T突变检测方法主要包括：
①
扩增阻滞突变系统法(amplifiedrefractory mutation system，ARMS)；
②
一代测序法(Sanger sequencing)；
③
二代测序法(next
‑
generation sequencing，NGS)。ARMS法虽然方便快捷、在临床广泛应用，但只能检测已知突变、且不能定量；一代测序通量小，耗时长；而NGS通量高、可一次性对几百万条至十亿条DNA分子进行并行测序，但对稀有突变及结构变异不敏感且价格昂贵，广泛应用仍受到限制。
[0004]数字PCR(Digital PCR)是一种新型的PCR技术，可以同时独立扩增、荧光检测数万个微反应孔。它具有更高的精度、重复性和灵敏度，并且可以定量检测突变基因，适合靶点定量、拷贝数变异(CNV)研究及罕见突变的检测。在临床上，数字PCR能实现绝对定量。这是优于qPCR法的相对定量的。尤其是对于检测低丰度突变样本更具有优势。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂和对照品。所述核酸扩增试剂包括反应液和ddPCRMix。
[0008]所述反应液中含有用于检测RET基因M918T突变的特异性引物、野生型荧光探针和突变型荧光探针。所述特异性引物包括一对上游引物和下游引物。所述荧光探针5
’
端添加荧光报告基团，3
’
端添加荧光猝灭基团。优选地，所述荧光探针为MGB探针。优选地，所述突变型型荧光探针5
’
端添加FAM基团，3
’
端添加MGB基团；所述野生型荧光探针5
’
端添加VIC基团，3
’
端添加MGB基团。优选地，所述特异性引物和荧光探针的序列与修饰如下：
[0009]上游引物5
’‑
CTCTTTAGGGTCGGATTCCAGTT
‑3’
[0010]下游引物5
’‑
TGCGTGGTGTAGATATGATCAAAA
‑3’
[0011]野生型探针5
’‑
FAM
‑
ATGGATGGCAATTG
‑
MGB
‑3’
[0012]突变型探针5
’‑
VIC
‑
AATGGACGGCAATTG
‑
MGB
‑3’
。
[0013]所述反应液中包含的特异性引物含量900nmol/L，荧光探针含量为250nmol/L。
[0014]所述ddPCRMix包括反应所需的dNTPs和缓冲液。优选地，所述ddPCR Mix为Droplet PCR Supermix。更优选地，Droplet PCR Supermix为2
×
工作液，配制时加入量为总体系量的一半。
[0015]所述对照品包括阳性对照和阴性对照。所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照为突变质粒和野生型质粒混合物。
[0016]优选地，所述突变型质粒所包含的RET基因片段序列如SEQ ID NO.1所示。所述野生型质粒所包含的RET基因片段序列如SEQ ID NO.2所示
[0017]本专利技术的第二个目的是提供上述检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒的检测方法，其特征在于，包含如下步骤：
[0018](1)根据不同样本类型选择相应商业DNA提取试剂盒进行DNA的提取，作为检测的模板；
[0019](2)配制RET M918T检测数字PCR反应液，其包含：
[0020][0021](3)在微滴生成芯片上，按先后顺序加微滴生成油70μL，数字PCR反应液20μL。微滴生成芯片放入样本制备仪里生成微滴。生成后的微滴转移到PCR扩增板上，用封膜仪进行封膜。
[0022](4)将PCR扩增板放置到PCR仪上进行扩增，扩增程序为：
[0023][0024](5)扩增完成，将PCR板放置到流式微滴检测仪内进行数据读取。获得数据后，划定阈值分析结果。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0026]本申请的试剂盒采用数字PCR技术，可对甲状腺结节细针穿刺活检样本中的RET M918T进行定量检测，从而辅助诊断甲状腺结节的良恶性；与其他检测手段相比，本试剂盒所采用的方法通过将传统的荧光PCR体系分割成数万个微反应单元，使得每个模板能够在独立的体系中进行扩增，大大提高了检测的灵敏度；此外由于数字PCR是通过有或无扩增信号来对微反应单元中是否有相应的模板进行计数，因而可以对每种模板的初始数量进行绝对定量，不再依赖于标准曲线，定量更加精准。
附图说明
[0027]图1为实施例1中RET基因M918T突变型引物探针设计原理示意图。
[0028]图2为实施例1中RET基因M918T野生型引物探针设计原理示意图。
[0029]图3为实施例2中试剂盒对RET基因M918T突变型模板检测结果图。
[0030]图4为实施例2中试剂盒对RET基因M918T野生型模板检测结果图。
[0031]图5为实施例2中试剂盒对RET基因M918T部分突变型模板检测结果图。
具体实施方式
[0032]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0033]实施例1
[0034]请参阅图1～2，所述反应液中含有用于检测RET基因M918T突变的特异性引物、野生型荧光探针和突变型荧光探针。所述特异性引物包括一对上游引物和下游引物。所述荧光探针5
’
端添加荧光报告基团，3
’
端添加荧光猝灭基团。优选地，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒，其特征在于，所述反应液中含有用于检测RET基因M918T突变的特异性引物、野生型荧光探针和突变型荧光探针。所述特异性引物包括一对上游引物和下游引物。所述荧光探针5
’
端添加荧光报告基团，3
’
端添加荧光猝灭基团。优选地，所述荧光探针为MGB探针。优选地，所述突变型型荧光探针5
’
端添加FAM基团，3
’
端添加MGB基团；所述野生型荧光探针5
’
端添加VIC基团，3
’
端添加MGB基团。优选地，所述特异性引物和荧光探针的序列与修饰如下：上游引物5
’‑
CTCTTTAGGGTCGGATTCCAGTT
‑3’
下游引物5
’‑
TGCGTGGTGTAGATATGATCAAAA
‑3’
野生型探针5
’‑
FAM
‑
ATGGATGGCAATTG
‑
MGB
‑3’
突变型探针5
’‑
VIC
‑
AATGGACGGCAATTG
‑
MGB
‑3’
；所述核酸扩增试剂还包括2
×
Droplet PCR Supermix。2.根据权利要求1所述的检测RET基因M918T突变的PCR试剂盒，其特征在于，所述反应液中包含的特异性引物含量为900nmol/L，荧光探针含量为...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨峰，龚伟，李雯，洪跟东，
申请(专利权)人：上海睿璟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：