【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，特别是涉及一种引物对及其制备方法。
技术介绍
1、基因突变检测被广泛的应用于肿瘤诊断。其检测手段有一代测序、ngs测序和荧光定量pcr检测等。一代测序的检测周期长、灵敏度低；ngs测序检测通量高，但是检测周期长、实验操作过程复杂、成本高、难以大规模应用。而荧光定量pcr灵敏度高、操作简洁、检测周期短、成本低、可及性强、能满足大多数医院和患者的应用需求。
2、荧光定量pcr(real-time quantitative polymerase chain reaction，rt-qpcr)是在pcr反应中加入荧光基团，通过实时连续监测荧光信号，来分析目的基因的初始量。对于识别基因点突变，突变阻滞扩增系统(amplification refractory mutation system，arms)被广泛应用。arms体系和荧光探针相结合，通过监测pcr扩增产物量的差别，可以区分野生型和突变型模板。但是普通arms体系在一些情况下特异性不好。尤其是在面对高gc模板，常常难以达到理想的扩增。
3、正常基因模板的gc含量在40％-60％之间。但超高gc含量的模板的gc含量高达80％。g和c碱基之间有3个氢键，分子间的作用力比较强。一般模板在94℃变性的时候，就可以变性打开。但超高gc模板就难以完成打开变成单链，比较难正常扩增。并且超高gc模板容易形成二级结构，影响引物、dna聚合酶与模板的正确结合。这些都大大降低扩增效率。另一方面，高gc引物容易错误退火，也就是结合到非目的区域，产生非特异性
4、市面上有一些针对高gc模板的添加剂，有些论文中也有这类研究，但基本上都是适用于60-70％ gc含量的模板。但用在超高gc模板上，效果并不明显。
5、因此，需要一种新的引物，来检测超高gc模板上的基因突变。
技术实现思路
1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种引物对及其制备方法和用途，用于解决现有技术中高gc模板，难以达到理想的扩增效果的问题。
2、为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种引物对，其特征在于，所述引物对中其中一条引物包含前序列、中间序列和后序列；所述前序列与突变模板完全匹配，所述中间序列与野生型模板存在碱基错配，所述后序列与野生型模板完全匹配。
3、优选地，所述前序列的长度为7-10bp；所述中间序列的长度为9-15bp；所述后序列的长度为12-16bp
4、本专利技术还提供一种用于检测基因突变的组合物，所述组合物中包括arms引物对，所述arms引物对为前述引物对。
5、本专利技术还提供前述引物对或前述组合物在扩增高gc含量的目的片段中的用途；所述目的片段的引物结合区域为高gc含量区域，所述高gc含量为鸟嘌呤碱基或胞嘧啶碱基占引物结合区域碱基总量70％以上。
6、本专利技术还提供高一种gc含量的目的片段的扩增方法，所述扩增方法包含如下特征：
7、1)使用前述引物对或权前述组合物扩增目的片段；
8、2)所述目的片段的引物结合区域为高gc含量区域，所述高gc含量为鸟嘌呤碱基或胞嘧啶碱基占引物结合区域碱基总量70％以上。
9、本专利技术还提供一种非治疗或非诊断目的的基因突变的检测方法，所述检测方法包含使用前述引物对或前述组合物扩增目的片段以检测目的片段是否发生基因突变。
10、本专利技术提供一种用于设计前述引物对的装置，所述装置包括：
11、1)目的基因片段获取模块：用于获取目的基因片段；
12、2)引物设计模块：用于根据目的基因片段设计引物，所述引物包含前序列、中间序列和后序列；所述前序列与突变模板完全匹配，所述中间序列与野生型模板或突变模板存在碱基错配，所述后序列与野生型模板或突变模板完全匹配；所述碱基错配为胞嘧啶和腺嘌呤形成地错配，或鸟嘌呤和胸腺嘧啶形成地错配。
13、本专利技术还提供一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如下引物设计方法：
14、s1，获取目的基因片段；
15、s2，根据目的基因片段设计引物，所述引物包含前序列、中间序列和后序列；所述前序列与突变模板完全匹配，所述中间序列与野生型模板或突变模板存在碱基错配，所述后序列与野生型模板或突变模板完全匹配；
16、所述引物设计方法还包含如下特征中的一种或多种：
17、1)所述前序列的长度为7-10bp；所述中间序列的长度为9-15bp；所述后序列的长度为12-16bp；
18、2)中间序列与野生型模板或突变模板间的碱基错配为嘌呤碱基和嘧啶碱基的错配；
19、3)中间序列与野生型模板或突变模板间错配的碱基数量为9-15bp；
20、4)中间序列与野生型模板或突变模板间错配的碱基连续分布；
21、5)所述后序列的熔解温度值为40-70℃。
22、本专利技术还提供一种电子终端，其特征在于，所述电子终端包括：处理器、存储器、网络接口和用户接口；所述存储器用于存储计算机程序，所述处理器用于执行所述存储器存储的计算机程序，以使所述终端执行前述计算机可读存储介质中引物设计方法。
23、如上所述，本专利技术的一种引物对及其制备方法和用途，具有以下有益效果：
24、本专利技术中的引物在扩增超高gc模板时扩增效率高，同时能高特异性的检测基因点突变。相比传统的设计方案，可以同时提高灵敏度和特异性、显著降低非特异性信号扩增，显著提高检出信号的灵敏度。尤其是在有较高野生型模板的背景下，准确检测到低拷贝的突变模板，重复性好。同时该引物不需要额外的基团修饰，比一般用锁核酸等修饰的引物成本大幅下降。本专利技术对于超高gc含量的复杂基因位点的检测具有良好效果，可以显著改善靶标信号的特异性和灵敏度，具有重要的应用价值。
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1.一种引物对，其特征在于，包括用于扩增目的基因的两条引物，所述引物对中至少一条引物包含前序列、中间序列和后序列；所述前序列与突变模板完全匹配，所述中间序列与野生型模板或突变模板存在碱基错配，所述后序列与野生型模板或突变模板完全匹配。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述前序列的长度为7-10bp；所述中间序列的长度为9-15bp；所述后序列的长度为12-16bp。
3.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，中间序列与野生型模板或突变模板间的碱基错配为嘌呤碱基和嘧啶碱基的错配；优选地，所述碱基错配为胞嘧啶和腺嘌呤形成地错配，或鸟嘌呤和胸腺嘧啶形成地错配。
4.根据权利要求3所述的引物对，其特征在于，所述中间序列与野生型模板或突变模板间的碱基错配包含如下特征的一种或两种：
5.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述后序列的熔解温度值为40-70℃。
6.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对为突变阻滞扩增系统中使用的引物对。
7.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述目的基
8.一种用于检测基因突变的组合物，其特征在于，所述组合物中包括ARMS引物对，所述ARMS引物对为权利要求1-7任一所述的引物对。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还包括荧光探针、DNA聚合酶、UDG酶、dNTPs或dUTP中的任一种或多种。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述荧光探针为Taqman探针，一端设有荧光报告基团，另一端设有荧光猝灭基团；优选地，荧光报告基团选自FAM、HEX、VIC、CY3、ROX、TEXAS RED、CY5；优选的，荧光猝灭基团选自TAMRA、MGB、BHQ1、Dabcyl、QYS-7、BHQ2。
11.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，还具有如下特征中的一种或多种：
12.权利要求1-7任一所述的引物对或权利要求8-11任一所述的组合物在扩增高GC含量的目的片段中的用途；所述目的片段的引物结合区域为高GC含量区域，所述高GC含量为鸟嘌呤碱基或胞嘧啶碱基占引物结合区域碱基总量70％以上。
13.一种高GC含量的目的片段的扩增方法，其特征在于，所述扩增方法包含如下特征：
14.一种非治疗或非诊断目的的基因突变的检测方法，其特征在于，所述检测方法包含使用权利要求1-7任一所述的引物对或权利要求8-11任一所述的组合物扩增目的片段以检测目的片段是否发生基因突变。
15.一种用于设计权利要求1-7所述的引物对的装置，所述装置包括：
16.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现如下引物设计方法：
17.一种电子终端，其特征在于，所述电子终端包括：处理器、存储器、网络接口和用户接口；所述存储器用于存储计算机程序，所述处理器用于执行所述存储器存储的计算机程序，以使所述终端执行权利要求16所述的计算机可读存储介质中引物设计方法。
...【技术特征摘要】
1.一种引物对，其特征在于，包括用于扩增目的基因的两条引物，所述引物对中至少一条引物包含前序列、中间序列和后序列；所述前序列与突变模板完全匹配，所述中间序列与野生型模板或突变模板存在碱基错配，所述后序列与野生型模板或突变模板完全匹配。
2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述前序列的长度为7-10bp；所述中间序列的长度为9-15bp；所述后序列的长度为12-16bp。
3.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，中间序列与野生型模板或突变模板间的碱基错配为嘌呤碱基和嘧啶碱基的错配；优选地，所述碱基错配为胞嘧啶和腺嘌呤形成地错配，或鸟嘌呤和胸腺嘧啶形成地错配。
4.根据权利要求3所述的引物对，其特征在于，所述中间序列与野生型模板或突变模板间的碱基错配包含如下特征的一种或两种：
5.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述后序列的熔解温度值为40-70℃。
6.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对为突变阻滞扩增系统中使用的引物对。
7.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述目的基因为高gc含量目的基因；优选地，所述目的片段的引物结合区域为高gc含量区域，所述高gc含量为鸟嘌呤碱基或胞嘧啶碱基占引物结合区域碱基总量70％以上；进一步优选地，所述目的基因选自tert；再进一步优选地，扩增目的基因的引物为包含核苷酸序列如seq id no：4-6或seq id no：11-12任一所示的多核苷酸。
8.一种用于检测基因突变的组合物，其特征在于，所述组合物中包括arms引物对，所述arms引物对为权利要求1-7任一所述的引物对。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：李雯，石涵，杨峰，洪跟东，
申请(专利权)人：上海睿璟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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