检测Siglec融合突变基因及GBS致病基因的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了检测Siglec融合突变基因以及GBS致病基因的试剂盒及其检测方法，用于对早产易感基因Siglec5/14融合突变及与GBS致病基因快速联合检测，可以有效评估妇科生殖道感染、孕产妇早产和新生儿感染风险，解决现有试剂盒仅对该条件致病菌进行检测，与疾病关联特异性差的问题，利用该试剂盒进行检测更快速、灵敏，检测过程全程闭管，避免电泳区分的额外操作，成本低，便于推广。便于推广。便于推广。

【技术实现步骤摘要】
检测Siglec融合突变基因及GBS致病基因的试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术涉及化学生物
，具体涉及检测Siglec融合突变基因及GBS致病基因的试剂盒及其检测方法。

技术介绍

[0002]当女性的天然免疫系统的中性粒细胞表面行使免疫应答的激活受体Siglec
‑
14在同源重组过程中与相似抑制受体Siglec
‑
5的发生融合突变，使得中性粒细胞仅存在Siglec
‑
5基因，如图1所示，Siglec5/14受体是在与早产、胎儿感染和胎儿损伤关键病原体B族链球菌(GBS)发生免疫应答时关键受体。传统上仅是通过检测是否存在GBS来评估风险，忽略了免疫系统在与病原体互作的免疫应答方面的作用。
[0003]早产是指妊娠满28周至不足37周间分娩者，早产儿的并发症包括各种身体问题，如视力或听力障碍、慢性肺病、心血管疾病、神经发育迟缓和行为缺陷。在我国早产的发病率大约是10％左右，早产儿中围产儿死亡率较正常足月儿高4
‑
6倍。大约40％的早产是由于阴道内的微生物失衡或者致病病原菌导致，如阴道加德纳菌，阴道阿托波菌、普雷沃菌，GBS等条件致病菌与早产风险密切相关。尤其是GBS，在非孕妇的携带率约为35％，孕妇的携带率约为20～26％。2021年《预防围产期B族链球菌病(中国)专家共识》，首次明确推荐对所有孕35～37周的孕妇行GBS筛查。而GBS携带率远高于发病率，仅是通过检测是否存在GBS来评估风险，忽略了免疫系统在与病原体互作的免疫应答方面的作用，并不能有效预测早产的发生。大量检出会导致无差别用药，加剧了抗生素耐药性的问题，对于孕期用药存在较大的限制，仅局限在少量抗生素中如红霉素，克林霉素，目前GBS对于它们的抗性大约在50％左右，临床上迫切需要通过精准诊断选择合理的治疗方案，可以有效减少抗生素的滥用，减轻抗生素耐药性问题。
[0004]GBS毒力因子在致病中起重要作用，如cps荚膜形成相关基因、免疫逃逸相关的cba基因、基底细胞表面laminin结合蛋白lmb基因的组成存在明显的多态性。并且GBS致病性与宿主天然免疫系统密切相关，例如可以通过cba基因编码的表面蛋白βProtein与中性粒细胞表面一对功能相反的唾液酸黏附蛋白受体(Siglec
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5和Siglec
‑
14)相互作用，激活或者抑制宿主免疫反应。
[0005]Siglec
‑
5和Siglec
‑
14在同一条染色体上，两个基因前后顺序排列，它们的5
’
端编码胞外序列的基因完全一致，而3
’
端编码胞内尾部序列差异较大，因此他们行使的功能大相径庭，Siglec
‑
5主要起到免疫抑制功能，而Siglec
‑
14主要起到免疫激活功能，二者的启动子序列也存在较大差异，在基因复制的过程中，由于Siglec
‑
5和Siglec
‑
14存在较长的同源序列，容易发生同源重组，导致Siglec
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5的尾部重组至它们的一致性序列之后，使Siglec
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14发生缺失突变，Siglec
‑
5利用Siglec
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14的启动子进行表达，仅产生Siglec
‑
5的表型(图1)。
[0006]宿主基因的差异与阴道微生态中菌群的差异共同作用引起早产发生的风险。GBS
阳性孕产妇中，Siglec
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14缺失突变型人群发生早产的比例远高于Siglec
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14野生型人群，在早产儿中，与Siglec
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14野生型等位基因相比，GBS定植与Siglec
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14缺失突变型等位基因有显著统计学相关性。
[0007]由于Siglec
‑
14和Siglec
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5野生型与Siglec
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14缺失突变型存在大量的一致性序列，其融合区域的长度大于1299bp，一致性大于99％，对于其检测存在较大的阻碍，利用普通的qPCR方法无法正常扩增，目前的检测方法多数是通过普通PCR扩增，针对启动子和尾部序列的差异，分别设计引物进行扩增，将PCR产物进行电泳检测，通过序列长度和条带数量区分野生型，突变型和杂合型基因。但是PCR实验操作复杂，需要电泳检测，通过肉眼对条带进行判断，无法进行大规模推广，目前尚未出现该类体外诊断检测。由于Siglec
‑
5和Siglec
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14胞外受体部分存在部分差异，可以利用特异性抗体进行识别，但是抗体孵育时间长，干扰大，容易引起非特异性结合，并且需要分离完整细胞进行检测，操作难度大，不利于医疗诊断及大规模推广。
[0008]目前针对早产的检测多数都是针对症状或代谢相关标志物进行诊断，如利用花生四烯酸乙醇酰胺(200580014584.7)、IL
‑
1β(201610330318.5)，但是这些只能在症状发生后进行检测，无法做到早诊断早干预。也有通过CLCN3、DAPP1等易感cfRNA标志物进行辅助诊断(201910890694.)，但是cfRNA含量低，需要有创检测，从血液中进行分离检测，操作复杂，灵敏度低。又如检测RANTES基因的多态性位点IN1.1T/C(201510050767.X)，这些方法忽略病原体与宿主的相关性，仅检测基因多态性变化，易造成漏检误检，并且该方法需要通过测序来进行相关位点变化，操作复杂，检测周期长。

技术实现思路

[0009]本专利技术要解决的技术问题是提供一种检测Siglec融合突变基因以及GBS致病基因的试剂盒及其检测方法，可以有效评估妇科生殖道感染、孕产妇早产和新生儿感染风险，解决现有试剂盒仅对该条件致病菌进行检测，与疾病关联特异性差的问题，有效降低抗生素滥用风险。
[0010]基于上述问题，本专利技术提出的技术方案是一种检测Siglec融合突变基因以及GBS致病基因的试剂盒，用于对早产易感基因融合突变的检测及与GBS致病基因快速联合检测，该试剂盒含有：
[0011]反应液I
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Siglec5/14突变检测用引物探针混合液：Siglec
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GAP
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F、Siglec
‑
GAP
‑
R、Siglec
‑
GAP
‑
P、Siglec
‑
L
‑
F、Siglec
‑
L
‑
R、Siglec
‑
S
‑
F、Siglec
‑
S
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R和Siglec
‑
S
‑
P；
[0012]反应液II
‑
GBS检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测Siglec融合突变基因以及GBS致病基因的试剂盒，其特征在于：用于对早产易感基因Siglec5/14融合突变的检测及与GBS致病基因快速联合检测，该试剂盒含有：反应液I
‑
Siglec5/14突变检测用引物探针混合液：Siglec
‑
GAP
‑
F、Siglec
‑
GAP
‑
R、Siglec
‑
GAP
‑
P、Siglec
‑
L
‑
F、Siglec
‑
L
‑
R、Siglec
‑
S
‑
F、Siglec
‑
S
‑
R和Siglec
‑
S
‑
P；反应液II
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GBS检测用引物、探针以及内参混合液：GBS
‑
F、GBS
‑
R、GBS
‑
P、RNP
‑
F、RNP
‑
R、RNP
‑
P；反应液III
‑
定量PCR检测GBS用引物、探针混合液：CBA
‑
F、CBA
‑
R、LMB
‑
F、LMB
‑
R、CBA
‑
P、LMB
‑
P；反应液IV
‑
qPCR检测GBS毒力基因检测用引物探针混合液：CPS1
‑
F、CPS1
‑
R、CPS2
‑
F、CPS2
‑
R、CPS3
‑
F、CPS3
‑
R、CPS4
‑
F、CPS4
‑
R、CPS1
‑
P、CPS2
‑
P、CPS3
‑
P、CPS4
‑
P；酶混合液：II Probe qPCR SuperMix；阴性对照：超纯水；阳性对照：含有扩增靶基因片段的人工合成质粒。2.根据权利要求1所述的检测Siglec融合突变基因以及GBS致病基因的试剂盒，其特征在于：Siglec
‑
GAP
‑
F、Siglec
‑
GAP
‑
R为正常Siglec基因之间非编码区序列的检测引物，Siglec
‑
GAP
‑
P为正常Siglec基因之间非编码区序列的检测探针，仅在第二轮qPCR反应时进行；Siglec
‑
L
‑
F靶向Siglec14基因启动子区域，为第一轮PCR上游扩增引物；Siglec
‑
L
‑
R靶向Siglec5基因的下游编码区域，为第一轮PCR下游扩增引物；Siglec
‑
S
‑
F为第二轮靶向融合突变基因的qPCR上游检测引物，Siglec
‑
S
‑
R为第二轮靶向融合突变基因的qPCR下游检测引物；Siglec
‑
S
‑
P为第二轮靶向融合突变基因的qPCR的检测探针。3.根据权利要求1所述的检测Siglec融合突变基因以及GBS致病基因的试剂盒，其特征在于：检测GBS所用引物及探针为GBS
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【专利技术属性】
技术研发人员：曹洋，汪大为，冯慧军，曾桢，张蕾，王琰，廖秦平，
申请(专利权)人：北京清华长庚医院，
类型：发明
国别省市：