The present invention provides a fluorescence quenching and quenching based on primers labeled target nucleic acid detection method, named PrimQuant, for the target nucleic acid quantitative real-time and allele identification, belonging to the real-time fluorescence quantitative PCR. Different from the two classical real-time fluorescent quantitative PCR techniques, which are the probe method and the dyestuff method, this invention has set up third kinds of technology - primer method in the field of qPCR. The present invention includes: 1) the PrimQuant design method, including real time PCR and allele identification of two kinds of scheme; 2) method with target nucleic acid quantitative real-time PrimQuant; 3) method of target nucleic acid alleles were identified by PrimQuant; 4) kit for target nucleic acid by real-time fluorescent quantitative PrimQuant; 5) kit for target nucleic acid alleles were identified by PrimQuant. The target nucleic acid detection method provided by the invention has the following advantages: 1) the design is simple: 2) the specificity is strong; 3) the quantitative precision 4) the sensitivity is high; 5) it can be multiple quantified.
【技术实现步骤摘要】
一种基于引物荧光和淬灭标记的靶核酸检测方法和试剂盒
本专利技术属于实时荧光定量PCR
技术背景1992年,Higuchi提出实时PCR设想。1996年,美国AppliedBiosystems公司实现了实时荧光定量的商品化。从那时起一直到现在,定量PCR技术在临床诊断和基础研究中始终发挥着巨大的作用,产生了极大的经济效益和社会效益,而且至今没有减弱的迹象。现有的实时荧光定量PCR技术分为染料法和探针法两大类。染料法通过可与双链DNA结合的嵌入型荧光染料来定量,所用染料包括溴乙锭、SYBRGreenI、SYBRGold、YO-PRO和YOYO等。这些染料与双链DNA结合后发出的荧光,比游离状态或者与单链DNA结合时强得多,所以可用于核酸的定量检测。染料法的优点是设计简单,不需要探针;缺点是非特异性,只能检测核酸总量,不能分辨不同的靶核酸,不能分辨靶核酸和引物二聚体等其他种类双链DNA,需要在PCR后通过熔解曲线进行确认;另外,染料法不能进行多重定量。探针法克服了染料法的这些缺点。实时荧光PCR技术的基本原理是荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的激发光谱波长重叠时,供体的荧光强度衰减,受体的荧光强度增强,这种现象即是FRET。现有的荧光探针种类较多,分为5类。1)TaqMan探针。TaqMan探针的5’端标记报告基团(R),3’端标记淬灭基团(Q),报告基团(R)可以是FAM、TET、VIC、JOE或HEX,淬灭基团(Q)可以是TAMRA或MGB ...
【技术保护点】
一种基于引物荧光和淬灭标记的靶核酸检测方法和试剂盒,其特征在于所述方法含有以下引物对PrimQuant™的设计方法、相关试剂盒和相关检验步骤:1)一组或多组荧光基团和淬灭基团标记的用于靶核酸实时荧光定量的引物对,命名为RT‑PrimQuant™;2)一组或多组荧光基团和淬灭基团标记的用于靶核酸等位基因鉴定的引物对,命名为GT‑PrimQuant™;3)用PrimQuant™进行靶核酸实时荧光定量的试剂盒;4)用PrimQuant™进行靶核酸等位基因鉴定的试剂盒;5)已知浓度的标准品或标准品梯度,阴性质控样本,阳性质控样本;6)检验步骤1:混合模板DNA、PrimQuant™引物对、PCR反应母液(master mix),必要时用水找补体积;7)检验步骤2:对于基因定量检验,设置重复反应、标准品梯度、阳性对照和阴性对照;对于等位基因鉴定检验,设置阳性对照和阴性对照;8)检验步骤3:设置PCR反应参数和荧光信号采集点;9)检验步骤4:启动仪器,进行PCR循环和信号采集;10)检验步骤5:分析数据。
【技术特征摘要】
1.一种基于引物荧光和淬灭标记的靶核酸检测方法和试剂盒,其特征在于所述方法含有以下引物对PrimQuant™的设计方法、相关试剂盒和相关检验步骤:1)一组或多组荧光基团和淬灭基团标记的用于靶核酸实时荧光定量的引物对,命名为RT-PrimQuant™;2)一组或多组荧光基团和淬灭基团标记的用于靶核酸等位基因鉴定的引物对,命名为GT-PrimQuant™;3)用PrimQuant™进行靶核酸实时荧光定量的试剂盒;4)用PrimQuant™进行靶核酸等位基因鉴定的试剂盒;5)已知浓度的标准品或标准品梯度,阴性质控样本,阳性质控样本;6)检验步骤1:混合模板DNA、PrimQuant™引物对、PCR反应母液(mastermix),必要时用水找补体积;7)检验步骤2:对于基因定量检验,设置重复反应、标准品梯度、阳性对照和阴性对照;对于等位基因鉴定检验,设置阳性对照和阴性对照;8)检验步骤3:设置PCR反应参数和荧光信号采集点;9)检验步骤4:启动仪器,进行PCR循环和信号采集;10)检验步骤5:分析数据。2.根据权利要求1所述的引物对PrimQuant™,其特征在于:1)用于实时荧光定量的RT-PrimQuant™由2条引物组成,两条引物的5’端各自连有一段互补配对的通用序列,称为粘连子;2)RT-PrimQuant™其中一条引物的粘连子5’端标记报告基团(Reporter,R);3)RT-PrimQuant™其中另一条引物的粘连子5’端标记淬灭基团(Quencher,Q);4)在同一个反应体系中,可以根据需要加入针对不同靶核酸的多组RT-PrimQuant™,实现多重基因定量;5)用于等位基因鉴定的GT-PrimQuant™由2组PrimQuant™组成;6)GT-PrimQuant™的上游引物或者下游引物分别标记不同的报告荧光基团,比如FAM和VIC;7)GT-PrimQuant™标记报告基团的那条引物的3’端或者3’端区域有1个或多个碱基分别与成对等位基因中的一种特异性互补,比如G/TSNP位点的G和T;8)GT-PrimQuant™的另一条引物标记淬灭基团,淬灭基团可以是一样的;9)在同一反应体系中,可以根据需要加入针对不同靶核酸的多组GT...
【专利技术属性】
技术研发人员:陈云弟,赵萱,陈薇,罗俊峰,
申请(专利权)人:上海阅尔基因技术有限公司,
类型:发明
国别省市:上海,31
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