一种分析颗粒细胞基因表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种分析颗粒细胞基因表达的方法，涉及基因检测技术领域。本发明专利技术通过细胞裂解、逆转录以及PCR扩增等流程制备基因表达文库，利用定量PCR对文库进行质控，纳米孔测序方法检测基因表达。其中，逆转录引物对应序列SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
一种分析颗粒细胞基因表达的方法


[0001]本专利技术涉及生物技术和分子生物学
，尤其涉及一种分析颗粒细胞基因表达的方法。

技术介绍

[0002]原始卵泡由一层扁平的卵泡细胞和一个未分化卵母细胞组成，它的启动生长分为2个阶段。首先，卵泡细胞由扁平变为立方形，开始增殖，同时伴随卵泡抑素表达。随后，形成由单层立方形的颗粒细胞和卵母细胞组成的初级卵泡。初级卵泡的细胞迅速分化增殖形成次级卵泡，此期的颗粒细胞增殖为2～3层。到三级卵泡时，颗粒细胞分化为多层并出现空腔。此后，颗粒细胞分化为两类细胞，即围绕卵泡壁的壁颗粒细胞和围绕卵母细胞的卵丘细胞。排卵后的卵泡细胞迅速转化成黄体细胞。黄体化的颗粒细胞形成大黄体细胞，而黄体化的内膜细胞转化成小黄体细胞。
[0003]在卵泡发生的起始阶段，卵泡细胞还没有形成功能型促性腺激素的受体，所以卵泡生长启动是促性腺激素非依赖性的。颗粒细胞和卵母细胞之间的相互作用可能是卵泡启动生长的原因。卵泡启动生长之后，卵母细胞和颗粒细胞分泌的因子以及来自血浆中的因子对调节卵泡的发育分化起重要作用。卵母细胞分泌的因子指导颗粒细胞的生长分化，调控卵泡发育。卵泡生长启动的具体信号分子机制目前仍不清楚，干细胞因子对此可能起重要作用。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种分析颗粒细胞基因表达的方法，通过细胞裂解、逆转录以及PCR扩增等流程制备基因表达文库，利用定量PCR对文库进行质控，纳米孔测序方法检测基因表达。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种分析颗粒细胞基因表达的方法，包括以下步骤：
[0006]S1、分离颗粒细胞并裂解；
[0007]S2、逆转录颗粒细胞mRNA为cDNA；
[0008]S3、PCR扩增cDNA得到文库；
[0009]S4、检测文库中的基因表达；
[0010]其中，逆转录引物与PCR扩增引物为同源序列。
[0011]进一步地，当体系中的颗粒细胞为单个时，可直接检测基因表达；当体系中的颗粒细胞为多个时，在PCR扩增cDNA后、检测基因表达前，还包括对扩增产物进行文库接头标记的步骤。
[0012]进一步地，所述文库接头标记为向PCR扩增产物中加入标签序列，所述标签序列长度10
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30bp，GC含量30％～70％。
[0013]进一步地，文库接头标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.4
‑
27。
[0014]进一步地，基因表达检测方法包括荧光定量PCR、高通量测序(NGS)与单分子测序
ID No.3。
[0038]一种标记大量颗粒细胞的寡核苷酸接头，由扩增序列与标签序列组成。所述扩增序列与PCR扩增引物序列相同。可选地，所述标签序列长度为10bp、20bp、30bp、40bp，GC含量为30％、40％、50％、60％、70％。所述寡核苷酸接头对应序列SEQ ID NO.4
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27。
[0039]一种用于cDNA文库质量控制的寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物扩增基因为GAPDH、HPRT1、B2M、ACTB、RPS18中的一个或多个；可选地，所述寡核苷酸引物用量为50nM、100nM、200nM、300nM、400nM。所述寡核苷酸引物对应序列SEQ ID NO.28
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37
[0040]所述PCR扩增试剂为常见商品化PCR扩增预混液，优选地，PCR扩增试剂为NEB公司LongAmp Taq Master Mix、TAKARA公司LA Taq Master Mix与康为世纪公司GoldStar Master Mix等。
[0041]实施例1单个颗粒细胞基因表达cDNA文库制备与质控
[0042](1)显微操作分离单个颗粒细胞，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞一次。
[0043](2)将细胞悬液转移到无核酸酶的PCR管中，用无核酸酶水将液体体积调整到9.5uL。
[0044](3)加入1uL裂解缓冲液，轻微离心收集液体至PCR管底，室温孵育5分钟裂解细胞。
[0045](4)在裂解细胞溶液中按下表加入逆转录试剂一：
[0046]试剂名称加入体积(1μL)逆转录反应液一1裂解细胞溶液9.5逆转录引物一2总体积12.5
[0047](5)将上述反应液置于预热的PCR仪中，72℃孵育3分钟，孵育结束后立即置于冰上。
[0048](6)在上述反应液中按下表加入逆转录试剂二：
[0049]试剂名称加入体积(μL)逆转录反应液二4逆转录引物二1RNA酶抑制剂0.5逆转录酶2
[0050](7)将反应液置于PCR仪中，运行如下逆转录程序：
[0051]温度(℃)时间(分钟)429070104维持
[0052](8)上述反应结束后，按下表向逆转录产物中直接加入PCR扩增试剂：
[0053]试剂名称加入体积(μL)PCR扩增缓冲液25PCR扩增引物1
DNA聚合酶1无核酸酶水3
[0054](9)将PCR反应体系置于PCR仪中，运行如下PCR扩增程序：
[0055][0056](10)PCR扩增结束后，将产物进行磁珠纯化。
[0057](11)按下表配制荧光定量PCR反应体系，对产物进行荧光定量PCR质控。
[0058]试剂名称加入体积(μL)荧光定量PCR反应液(2X)10PCR引物混合液(10μM)1磁珠纯化的PCR产物2无核酸酶水～20
[0059](12)将荧光定量PCR反应体系置于定量PCR仪中，运行如下反应程序：
[0060][0061](13)荧光定量PCR结束后，分析单细胞样本目标基因扩增结果，判定单细胞文库质量。
[0062]实施例2多个细胞基因表达cDNA文库制备
[0063](1)收集多个细胞，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞一次。
[0064](2)将细胞悬液分别转移到无核酸酶PCR管中，用无核酸酶水将液体体积调整到9.5uL。
[0065](3)加入1uL裂解缓冲液，轻微离心收集液体至PCR管底，室温孵育5分钟裂解细胞。
[0066](4)在裂解细胞溶液中按下表加入逆转录试剂一：
[0067]试剂名称加入体积(1μL)逆转录反应液一1裂解细胞溶液9.5逆转录引物一2总体积12.5
[0068](5)将上述反应液置于预热的PCR仪中，72℃孵育3分钟，孵育结束后立即置于冰上。
[0069](6)在上述反应液中按下表加入逆转录试剂二：
[0070]试剂名称加入体积(μL)
逆转录反应液二4逆转录引物二1RNA酶抑制剂0.5逆转录酶2
[0071](7)将反应液置于PCR仪中，运行如下逆转录程序：
[0072]温度(℃)时间(分钟)429070104维持
[0073](8)上述反应结束后，按下表向逆转录产物中直接加入PCR扩增试剂：
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分析颗粒细胞基因表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、分离颗粒细胞并裂解；S2、逆转录颗粒细胞mRNA为cDNA；S3、PCR扩增cDNA得到文库；S4、检测文库中的基因表达；其中，逆转录引物与PCR扩增引物为同源序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：当体系中的颗粒细胞为多个时，在PCR扩增cDNA后、检测基因表达前，还包括对扩增产物进行文库接头标记的步骤。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述文库接头标记为向PCR扩增产物中加入标签序列，所述标签序列长度10
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30bp，GC含量30％～70％。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：文库接头标记的核苷酸序列为SEQ ID NO.4
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27。5.根据权利要求1所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗俊峰，李仁强，
申请(专利权)人：上海阅尔基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：