检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及核酸体外扩增检测的技术领域，具体提供了一种检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，该检测方法利用非特异性荧光染料和特异性探针在不同温度下发出荧光信号不一样的原理，实现了能够利用较少的荧光通道数检测更多的靶点，有助于解决实时荧光PCR检测通量低、检测成本高和检测时间长的问题。问题。

【技术实现步骤摘要】
检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及核酸体外扩增检测的
，具体涉及一种检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]实时荧光定量PCR(Quantitative Real
‑
time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。该技术具有操作简便、快速高效、高敏感性等特点，已广泛用于分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等诸多研究领域，是快速检测的现代方法之一。
[0003]目前常用的荧光PCR仪，主要提供2
‑
5种荧光通道，一般情况下，荧光定量PCR检测时可以利用一个荧光通道作为内参，其余荧光通道用于检测待测标本。现有的实时荧光定量PCR技术存在检测靶点数量有限的缺陷，例如在2通道仪器中，现有技术中一般只能检测1个靶点，另1个用于检测内参；即使在4通道仪器中，现有技术中最高检测3
‑
4个靶点。而荧光PCR仪价格昂贵，荧光通道数越多，价格越贵。因此，如何利用较少的荧光通道数检测更多的靶点对于快速检测领域的技术人员来说是一直面临的难题。
[0004]因此，研发一种能够实现检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术存在的上述问题，提供一种能够实现检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，有助于解决实时荧光PCR检测通量低、检测成本高和检测时间长的问题。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供了一种检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：
[0007](1)当荧光通道数为m，检测n个靶序列，且n>m时，根据n个靶序列分别设计n对特异性引物和m个荧光探针；其中，m为≥1的正整数，n为≥2的正整数；
[0008](2)配制PCR体系，所述PCR体系包括n对特异性引物、m个荧光探针和n
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m个荧光染料；m个靶序列分别采用第一、第二、......第m荧光探针检测，n
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m个靶序列分别采用第一、第二、......第n
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m荧光染料检测；
[0009]其中，检测荧光染料的荧光通道与至少一种检测荧光探针的荧光通道相同；
[0010](3)设定PCR程序，设定预变性的第一温度和第一时间，变性的第二温度和第二时间，退火延伸的第三温度和第三时间，循环次数：
[0011]其中，在PCR扩增的整个循环过程中，在第二温度时采集荧光探针的荧光信号，以及在第三温度时采集荧光探针和荧光染料的总荧光信号，分别记录荧光信号强度；
[0012](4)依据步骤(3)记录的荧光信号强度，计算n
‑
m个靶序列的荧光信号强度差异值；若差异值大于阈值，则判定n
‑
m个靶序列有扩增产物；若差异值小于阈值，则判定n
‑
m个靶序列没有扩增产物。
[0013]需要说明的是，本专利技术中“第一”、“第二”等数字表示方式仅仅用于区分不同的物质或使用方式，不代表顺序的区别。
[0014]所述步骤(1)中，荧光通道数m代表荧光PCR仪中能够检测的不同荧光颜色的检测器数目，此处限定m为≥1的正整数，m的最大取值与使用的荧光PCR仪型号参数直接相关，在此处对m的最大取值不作具体限定。
[0015]优选地，所述m为1、2、3、4、5、6、7或8，更优选m为2、3、4、5或6，对m的取值进一步限定，使其与目前常用的荧光PCR仪的荧光通道数目相符。
[0016]靶序列个数n的取值与荧光通道数m直接相关，只要满足n为≥2的正整数，n>m的条件即可。
[0017]优选地，所述n为2、3、4、5、6、7、8或9，更优选n为3、4、5、6或7。
[0018]本专利技术的专利技术人发现，当n>m时，使用荧光通道数为m的荧光PCR仪检测n个靶序列时，由于通常情况下一个荧光通道只能检测一个靶序列，因此会出现荧光通道数不能满足检测靶序列数目的情况，为了使检测靶序列数多于荧光通道数，本专利技术利用非特异性荧光染料和特异性探针在不同温度下发出荧光信号不一样的基础上，开发出了本专利技术的检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，有助于解决实时荧光PCR检测通量低、检测成本高和检测时间长的问题。
[0019]所述步骤(1)中，根据n个靶序列分别设计n对特异性引物，在构建PCR体系时将靶序列的模板和对应的特异性引物同时加入，以保证靶序列能够顺利的进行PCR扩增。
[0020]所述步骤(1)中，根据n个靶序列分别设计m个荧光探针，其含义是指有其中n
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m个靶序列是无需设计荧光探针的，因为荧光通道数m的取值有限，最多只能检测m个不同的荧光探针发出的荧光信号，因此只需设计m个探针对应m个靶序列进行标记即可。
[0021]所述步骤(2)中，配制的PCR体系包括n对特异性引物、m个荧光探针和n
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m个荧光染料。
[0022]上述荧光探针为特异性结合靶序列的一段线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，荧光报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，荧光PCR仪检测不到荧光信号；PCR扩增时(在延伸阶段)，荧光探针和各自目的模板结合，Taq酶的5
’‑3’
外切酶活性将荧光探针酶切降解，使报告荧光基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光PCR仪的荧光监测系统可接收到荧光信号。随着反应的进行，扩增产物不断积累，荧光信号等比例增加，每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图。荧光探针一旦被酶切降解，其发出的荧光信号一直存在，与温度变化无关，无论是低温(例如退火延伸的温度)或高温(例如变性的温度)，荧光PCR仪都能够检测到荧光探针发出的荧光信号。
[0023]对于荧光探针的选择不做具体限定，可以选择本领域常规使用的荧光探针，例如所述荧光探针可以为TaqMan探针。
[0024]优选地，所述TaqMan探针选自FAM探针、ROX探针、Cy3探针、Cy5探针、TET探针、HEX探针、JOE探针和TAMRA探针中的一种或多种。
[0025]本专利技术中，所述荧光染料是指直接与双链DNA(dsDNA)结合的荧光染料，其能够与所有的PCR产物(dsDNA)结合，而不能特异性区分是何种靶序列，即荧光染料是非特异性结合。PCR产物在低温时(例如退火延伸的温度)呈双链结构，结合的荧光染料能被荧光PCR仪检测到荧光信号，而PCR产物处于高温时(例如变性的温度)呈解链状态，荧光染料无法结合，因此此时荧光PCR仪无法检测到荧光染料的荧光信号。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测靶序列数多于荧光通道数的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)当荧光通道数为m，检测n个靶序列，且n&gt;m时，根据n个靶序列分别设计n对特异性引物和m个荧光探针；其中，m为≥1的正整数，n为≥2的正整数；(2)配制PCR体系，所述PCR体系包括n对特异性引物、m个荧光探针和n
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m个荧光染料；m个靶序列分别采用第一、第二、......第m荧光探针检测，n
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m个靶序列分别采用第一、第二、......第n
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m荧光染料检测；其中，检测荧光染料的荧光通道与至少一种检测荧光探针的荧光通道相同；(3)设定PCR程序，设定预变性的第一温度和第一时间，变性的第二温度和第二时间，退火延伸的第三温度和第三时间，循环次数：其中，在PCR扩增的整个循环过程中，在第二温度时采集荧光探针的荧光信号，以及在第三温度时采集荧光探针和荧光染料的总荧光信号，分别记录荧光信号强度；(4)依据步骤(3)记录的荧光信号强度，计算n
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m个靶序列的荧光信号强度差异值；若差异值大于阈值，则判定n
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m个靶序列有扩增产物；若差异值小于阈值，则判定n
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m个靶序列没有扩增产物。2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述m为1、2、3、4、5、6、7或8，所述n为2、3、4、5、6、7、8或9；优选地，所述m为2、3、4、5或6，所述n为3、4、5、6或7；优选地，n
‑
m＝1。3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述PCR程序的条件包括：第一温度为94
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97℃，第一时间为2
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10min；第二温度为94
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97℃，第二时间为5
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30s；第三温度为45
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75℃，第三时间为10
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60s；循环次数为30
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50次。4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述步骤(3)中，在前2
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15个和后2
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15个循环的第三温度时采集荧光信号；优选地，所述步骤(3)中，在前2
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5个和后2
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5个循环的第三温度时采集荧光信号。5.根据权利要求2所述的检测方法，其中，当n
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：王战会，侯旭彤，
申请(专利权)人：微纳芯苏州科技有限公司，
类型：发明
国别省市：