一种羊肚菌菌丝体的交配型分离方法技术

本发明专利技术涉及羊肚菌菌丝体的交配型分离方法，可有效解决羊肚菌菌丝体的交配型如何分离的问题，其解决的技术方案是，包括以下步骤:1）制备羊肚菌菌丝体的原生质体；2）制备羊肚菌交配型的DNA模板；3）扩增羊肚菌交配型的DNA模板；4）羊肚菌交配型的琼脂糖凝胶电泳分离；本发明专利技术分离方法由原生质体分离得到的单交配型的六妹羊肚菌，在扩大培养过程中，交配型基因是稳定的，不易退化的，液体培养法制备的原生质体更有活力，更有利于后续的遗传育种研究工作，是羊肚菌菌丝体的交配型的分离方法上的创新。新。新。

【技术实现步骤摘要】
一种羊肚菌菌丝体的交配型分离方法


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是一种羊肚菌菌丝体的交配型分离方法。

技术介绍

[0002]羊肚菌(Morchella)是一种珍稀食药用菌，它富含氨基酸、多糖、矿质元素等多种营养成分和抗肿瘤、抗菌、保护心血管、增强免疫力等功效成分，广受世界各国人民喜爱。近年来，羊肚菌人工栽培技术取得重要进展，在“外营养袋”栽培模式引领下，易出菇羊肚菌品种如梯棱羊肚菌(Morchella importuna)、六妹羊肚菌(Morchella sextelata)和七妹羊肚菌 (Morchella eximia)的商业化栽培迅猛发展，栽培面积已超过8000公顷且仍在不断增加。大量研究表明，羊肚菌是一种单极性异宗结合子囊菌，每个菌丝细胞含有15～42个细胞核(其子囊孢子也为含有 18～32个细胞核的多核细胞)，每个细胞核只有一个交配型，不同交配型的细胞核在菌丝细胞内共存呈异核状态；然而，两种交配型的细胞核在菌丝细胞中的分布是随机的，因此造成在羊肚菌的无性扩繁过程中常常发生一种交配型丢失的现象，这种现象被认为是羊肚菌菌种不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羊肚菌菌丝体的交配型分离方法，其特征在于，包括以下步骤:1）制备羊肚菌菌丝体的原生质体将羊肚菌斜面菌株接种于CYM玻璃纸平板上，24℃倒置培养72h，长刀片刮下转接于CYM液体培养基中，24℃静置培养3～4d，过滤收集幼嫩菌丝体，用无菌水、甘露醇洗涤4次；加入到混合酶液中，0.22
µ
m滤膜过滤灭菌；或CYM玻璃纸培养的幼嫩菌丝体直接加入混合酶液中，0.22
µ
m滤膜过滤灭菌；酶解条件：30℃、60r/min酶解2.5～3.5h，然后通过G2烧结玻璃漏斗过滤，原生质体滤液离心洗涤、浓缩2～3次，4000 r/min
×
10 min，60%蔗糖垫底，0.6 mol/L甘露醇适当稀释后取100～200
µ
L涂布于CYM再生培养基平板，正立静置30min后封口膜封口、24℃倒置培养65～120h；2）制备羊肚菌交配型的DNA模板小心挑取步骤1）中CYM再生培养基平板上出现的单菌落至PDA培养基斜面上，编号，置于24 ℃生化培养箱中培养7～14 d，4～12 ℃冰箱保藏；取斜面保藏菌株的少量菌丝置于2mL离心管内，加入300μL裂解液、200
‑
300粒粒径为0.5
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0.6mm的玻璃珠，研磨2～3 min，75 ℃水浴20min，取上清100μL，加入无水乙醇300μL，12000 r/min离心5min.，弃去上清液，沉淀加入400μL70%乙醇12000 r/min离心5min，弃去上清液， DNA沉淀风干20min；风干DNA用50μL ddH2O溶解、震荡悬浮，作为DNA模板备用；3）扩增羊肚菌交配型的DNA模板DNA扩增中，配置15μL扩增体系：2
×
ES TaqMAsterMix7.5μL，10μmol/L的P8
‑
4F、P8
‑
4R引物对，或P6
‑
1F、P6
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1R引物对各0.5μL，DNA模板1μL，dd H2O 5.5μL；PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，35个循环；72 ℃延伸5 min；得扩增后的羊肚菌交配型D...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘彬，周伏忠，刁文涛，巩涛，陈晓飞，宁萌，郭恒，李志金，
申请(专利权)人：河南省科学院，
类型：发明
国别省市：