一种基于多重PCR的多靶标检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于多重PCR的多靶标检测方法,本发明专利技术主要是通过在荧光定量PCR扩增之前先对样本中的目标区域先进行多重PCR预扩增，再将预扩增产物分液至各荧光定量PCR的孔位中进行第二次扩增和荧光显色，通过本方法的预扩增，可将扩增产物轻松的分成数十个孔位且不影响检测性能。即通过本方法，对于单样本可轻松的将检测靶标数量相比于常规的方法提升10倍以上，同时采用本方法后，两轮扩增分别扩增的循环数均有所减少，可以适当的减少气溶胶的干扰，也可以减少由于单引物由于循环数过多而导致的非特异信号。而导致的非特异信号。而导致的非特异信号。

【技术实现步骤摘要】
一种基于多重PCR的多靶标检测方法


[0001]本专利技术涉及荧光定量以及多重PCR检测
，具体为一种基于荧光定量PCR平台的多靶标检测方法。

技术介绍

[0002]荧光定量是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
[0003]常规的荧光定量PCR由于单孔检测通道有限(一般4
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6个通道)，如果需要检测多靶标，需要将检测样本分成较多份进行检测，但是将样本分成较多份数，会受到样本或核酸总体积以及靶标模板的拷贝有限的限制，或者需要将模板稀释导致检测灵敏度收到影响，为此，目前的荧光定量PCR对于单个样本能够进行同时检测的靶标数量非常有限，一般将样本分成3
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4个孔位已经非常吃力。为此，本专利技术提供一种多重PCR的多靶标检测方法，在常规的荧光定量PCR平台上，可将轻松检测靶标的数目提高10倍以上，且不影响各靶标的检测灵敏度。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种基于多重PCR的多靶标检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的目前的荧光定量PCR对于单个样本能够进行同时检测的靶标数量有限的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]一种多重PCR的多靶标检测方法，具体步骤包括如下：
[0007]S1.首先将样本中的核酸加入预扩增的PCR管中,该PCR管中预先放置了本次需要检测靶标的预扩增引物以及其它相关反应体系；
[0008]S2.将S1步骤中加入的核酸进行PCR扩增，这些检测靶标的核酸序列得到第一次富集；
[0009]S3.将S2步骤中的扩增产物分到多个常规荧光定量PCR管中，荧光定量PCR管预先放好不同靶标的引物或探针，第一轮预扩增的产物，可被这些引物扩增；
[0010]S4.将S3步骤中的多个荧光定量PCR管放入荧光定量PCR仪器中进行第二轮PCR扩增；
[0011]其中，S1～S3步骤中，检测靶标的扩增为超多重PCR预扩增，超多重PCR预扩增为第一轮扩增，超多重扩增的循环数为2～30次。
[0012]S3步骤中，预扩增的PCR管中上层为油相，下层为水项，PCR反应在下层水项中进行，该方法可以控制下一步分液操作时的气溶胶污染。
[0013]S4步骤中，第二轮扩增循环数为10～50次。
[0014]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0015]本方法在基于荧光定量PCR扩增区域，进行特殊引物设计进行预扩增，可以很好的
解决样本分孔有限的问题，进而解决利用荧光定量PCR检测检测超多靶标难题。通过本方法的预扩增，可将扩增产物轻松的分成多个孔位且不影响检测性能，即通过本方法，对于单样本可轻松的将检测靶标数量相比于常规的方法提升10倍以上，同时采用本方法后，两轮扩增分别扩增的循环数有所减少，可以适当的减少气溶胶的干扰，也可以减少由于单引物由于循环数过多而导致的非特异信号。
附图说明
[0016]图1为本专利技术的检测流程图；
[0017]图2为本专利技术的分液示例图；
[0018]图3为本专利技术实施例中扩增产物分布图。
具体实施方式
[0019]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]实施例
[0021]请参阅图1
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3，本专利技术提供一种技术方案：
[0022]一种基于荧光定量PCR平台的多靶标检测方法，本专利技术主要是通过在荧光定量PCR扩增之前先对样本中的目标区域先进行超多重PCR预扩增，再将预扩增产物分液至荧光定量PCR的孔位中进行第二次扩增和荧光显色，具体步骤包括如下：
[0023]S1.首先将样本中的核酸加入预扩增的PCR管中,该PCR管中预先放置了本次需要检测靶标的预扩增引物以及其它相关反应体系；
[0024]S2.将S1步骤中加入的核酸进行PCR扩增，这些检测靶标的核酸序列得到第一次富集；
[0025]S3.将S2步骤中的扩增产物分到多个常规荧光定量PCR管中，荧光定量PCR管预先放好不同靶标的引物和探针，第一轮预扩增的产物，可被这些引物扩增；
[0026]S4.将S3步骤中的多个荧光定量PCR管放入荧光定量PCR仪器中进行第二轮PCR扩增；
[0027]S5.通过不同管号和荧光信号来判断不同靶标的检出情况。
[0028]进一步说明的，S1～S3步骤中，检测靶标的扩增为超多重PCR预扩增，超多重PCR预扩增为第一轮扩增，超多重扩增的循环数为2～30次；
[0029]S3步骤中，预扩增的PCR管中上层为油相，下层为水项，PCR反应在下层水项中进行，该方法可以控制下一步分液操作时的气溶胶污染；
[0030]S4步骤中，第二轮扩增循环数为10～50次；
[0031]通过上述步骤，以下是对64个靶标的孔号以及荧光通道进行检测，靶标具体为下表(表一)：
[0032]分组FAMVICTexas RedCy5A1肺炎链球菌流感嗜血杆菌布鲁菌属内参
B1百日咳杆菌惠普尔养障体嗜肺军团菌内参C1肺炎支原体人博卡病毒肺炎衣原体内参D1鸟分枝杆菌胞内分枝杆菌脓肿分枝杆菌内参E1马尔尼菲青霉菌人结核分枝杆菌构巢曲霉内参F1豚鼠耳炎诺卡菌盖尔森基兴诺卡菌脓肿诺卡菌内参G1阿萨丝孢酵母热带念珠菌光滑念珠菌内参H1黑曲霉土霉菌黄曲霉内参A2新生隐球菌杂色曲霉米曲霉内参B2近平滑念珠菌葡萄牙念珠菌克柔念珠菌内参C2鸟肠球菌粪肠球菌屎肠球菌内参D2金黄色葡萄球菌葡萄球菌属沙门氏菌内参E2肺炎克雷伯菌铜绿假单胞菌嗜麦芽窄食单胞菌内参F2洋葱伯克霍尔德菌大肠杆菌阴沟肠杆菌内参G2人类疱疹病毒1型巨细胞病毒EB病毒内参H2梅毒螺旋体解脲支原体沙眼衣原体内参
[0033](表一)
[0034]根据上表的标靶进行核酸富集预扩增，具体为：
[0035]一、将样本扩增需要的核酸加入PCR管中；
[0036]二、将PCR扩增需要的酶以及所有靶标对应的引物加入PCR管中；上述中的各成分取用体积如下表(表二)：
[0037][0038][0039](表二)
[0040]三、对PCR管放置于PCR仪中进行预扩增，具体扩增条件为下表(表三)：
[0041][0042](表三)
[0043]将扩增产物进行分管，扩增产物按照如下列的孔位顺序，依次分液至各个孔位中，具体如说明书附图3所示。
[0044]对应的PCR孔孔预先放置了表中A1
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H2对应各靶标需要的引物和探针，上述中的各成分取用体积如下表(表四)：
[0045]名本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于多重PCR的多靶标检测方法,其特征在于：本发明主要是通过在荧光定量PCR扩增之前先对样本中的目标区域先进行超多重PCR预扩增，再将预扩增产物分液至荧光定量PCR的孔位中进行第二次扩增和荧光显色，具体步骤包括如下：S1.首先将样本中的核酸加入预扩增的PCR管中,该PCR管中预先放置了本次需要检测靶标的预扩增引物以及其它与PCR相关的酶，dNTP等反应体系；S2.将S1步骤中加入的核酸进行PCR扩增，这些检测靶标的核酸序列得到第一次富集；S3.将S2步骤中的扩增产物分到多个常规荧光定量PCR管中，荧光定量PCR管预先放好不同靶标的引物或探针，第一轮预扩增的产物，可被这些引物扩增；S4.将S3步骤中的多个荧光定量PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄文潘，浦浩，
申请(专利权)人：上海冰缘医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：