基于pt-NGS的心脏感染病原体检测引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了基于pt

【技术实现步骤摘要】
基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测引物组、试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测引物组、试剂盒及方法。
技术背景
[0002]心肌炎是常见的心肌炎性疾病，占青少年猝死病因的42％，也是心脏移植最常见的适应征。病毒是导致感染性心肌炎的最常见病因，可通过心肌活检组织PCR测序明确病原体。中国人心肌炎的病原体分布情况尚不清楚。由于病原不明，心肌炎的治疗策略目前仅以对症支持为主，患者可能进展至心肌病和终末期心衰。
[0003]临床迫切需要一种能够快速明确心脏是否存在现症感染的检测方法。既往研究发现，嗜心肌病毒可能仅在组织中复制表达，而外周血核酸检测阴性。心肌活检是明确组织感染的唯一途径，但检测心脏病原存在下述困难：
[0004]1、活检组织中病原核酸量少，传统测序方法只能检测几种特定病毒，可能导致漏诊。
[0005]2、RNA病毒离体后不易保存，现有临床手段无法检测嗜心肌RNA病毒。
[0006]3、目前国内尚无检测嗜心肌病毒的成品panel(基因组合/基因包)。
[0007]4、细菌、真菌、原虫多种病原微生物可导致心肌炎，但检测这些病原体需要更多组织，并采取病原培养等不同原理的检测方法，耗时较长，时效性难以满足临床需求。
[0008]与非靶向的宏基因组测序所使用的核酸片段随机测序法不同，基于二代测序的病原靶向测序(Pathogen targeted NGS，pt
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NGS)使用大量针对目标病原体的引物对样品中的核酸进行多重PCR扩增，再通过高通量测序对扩增产物进行同步定量分析。前期该技术已成功应用于呼吸道和脑脊液的病原体检测。鉴于ptNGS结合了PCR检测的高灵敏度以及测序反应的高特异性，特别适于应用于微量样本，将该技术应用于心脏感染病原体检测极具潜力。
[0009]目前关于心肌炎病原体分布的文献均来自于国外，常见病毒包括细小病毒B19及柯萨奇病毒B组。但中国人群心肌炎的病原谱尚不清楚。由于缺乏敏感高效的心肌病原检测手段，目前对于感染性心肌炎病因治疗手段有限。
[0010]为了开发批量检测心脏病原体的试剂盒，前期申请人团队尝试了另一种相对应用广泛的二代测序方法——宏基因组测序，该技术已被应用于心内膜炎、中枢神经感染的病原学诊断。但结果显示该方法造价昂贵且易受人源核酸片段干扰。

技术实现思路

[0011]针对上述存在的技术局限性，为了降低测序成本，避免人源核酸序列干扰，加快检测流程，及时迅速指导临床用药，本专利技术提出了基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测引物组、试剂盒及方法；其是申请人通过查找文献并结合前期的实验结果，采用pt
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NGS原理，个性化定制了一款全面检测嗜心肌病毒、细菌、真菌、寄生虫及其他微生物的心脏病原体检测流
程；并形成试剂盒向临床推广，解决无法批量鉴定心脏感染病原体的临床痛点，将中国心肌炎的诊断检测水平提升至国际一流水平，克服了
技术介绍
中提到的不足和缺陷。
[0012]为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0013]本专利技术的专利技术点是提供了基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测引物组，包括第1引物对至第103引物对，其中，第n引物对由SEQ ID No.(2n
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1)所示的第n正向扩增引物和SEQ ID No.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～103。
[0014]具体的，所述心脏感染病原体检测引物组包括如下表1所示的引物对。
[0015]表1表1
[0016]具体如表2所示。
[0017]表2
[0018]可选地，上述的基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测引物组，每条正向扩增引物的5'端连接有SEQ ID No.207所示的正向通用引物，每条反向扩增引物的5'端连接有SEQ ID No.208所示的反向通用引物。
[0019]正向通用引物SEQ ID No.207：
[0020]caagcagaagacggcatacgagat；
[0021]反向通用引物SEQ ID No.208：
[0022]aatgatacggcgaccaccgagatctacac。
[0023]可选地，上述的基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测引物组，还包括有接头引物对，接头引物对为SEQ ID No.209所示的正向接头引物和SEQ ID No.210所示的反向接头引物。
[0024]正向接头引物SEQ ID No.209：
[0025]gtgactggagttccttggcacccgagaattcca；
[0026]反向接头引物SEQ ID No.210：
[0027]acactctttccctacacgacgctcttccgatct。
[0028]本专利技术的第二个专利技术点是提供了一种基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测试剂盒，此种试剂盒包括有上述的心脏感染病原体检测引物组。
[0029]可选地，上述的基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测试剂盒，所述试剂盒还包括逆转录酶和DNA聚合酶。
[0030]可选地，上述的基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测试剂盒，所述试剂盒还包括样本总DNA提取试剂、PCR扩增产物纯化磁珠。
[0031]样本总DNA提取试剂可以是任意能够提取样本总DNA的试剂、试剂组合或商品化的试剂盒。
[0032]试剂盒产品的组成成分、规格、数量及保存条件如下表3所示。
[0033]表3组分名称包装规格(100次)数量保存条件5
×
RT Mix400μl/管1
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20℃PO Panel Mix400μl管1
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20℃3
×
T_Enzyme Mix1ml管2
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20℃IAC
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PO
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09100μl1
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20℃2PCR BarcodeXX F15μl8
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20℃
2PCR BarcodeXX R15μl8
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20℃DNA clean beads8.4ml12
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8℃
[0034]表3中，5
×
RT Mix：逆转录酶，用于将RNA逆转录为cDNA；
[0035]PO Panel Mix：超多重PCR引物panel；
[0036]3×
T_Enzyme Mix：DNA聚合酶，用于PCR扩增；
[0037]IAC
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PO：人工合成若干条两端包含与所述扩增子的引物互补配对片段的差异靶标序列，用以提高扩增文库质量(序列选自公开号C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测引物组，其特征在于，包括第1引物对至第103引物对，其中，第n引物对由SEQ ID No.(2n
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1)所示的第n正向扩增引物和SEQ ID No.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～103。2.根据权利要求1所述的基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测引物组，其特征在于，每条正向扩增引物的5'端连接有SEQ ID No.207所示的正向通用引物，每条反向扩增引物的5'端连接有SEQ ID No.208所示的反向通用引物。3.根据权利要求2所述的基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测引物组，其特征在于，还包括有接头引物对，接头引物对为SEQ ID No.209所示的正向接头引物和SEQ ID No.210所示的反向接头引物。4.一种基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
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3任一所述的心脏感染病原体检测引物组。5.根据权利要求4所述的基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录酶和DNA聚合酶。6.根据权利要求5所述的基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本总DNA提取试剂、PCR扩增产物纯化磁珠。7.一种非诊断和治疗目的基于pt
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NGS的心脏感染病原体检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.获得待测样本的总DNA/RNA；S2.将步骤S1中获得的RNA逆转录为cDNA；S3.以步骤S1获得的总DNA和步骤S2中逆转录反应得到的cDNA为模板，利用权利要求2所述的引物组进行超多重PCR扩增；S4.以步骤S3获得的超多重PCR扩增产物以及对照DNA作为...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘颖娴，徐希奇，荆志成，郭帆，方理刚，
申请(专利权)人：上海冰缘医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：