腺病毒7型的LAMP检测引物组和检测方法与应用、试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，尤其涉及腺病毒7型的LAMP检测引物组和检测方法与应用、试剂盒，所述LAMP检测引物组基于如SEQ ID NO.1所示的腺病毒7型的特异性保守基因序列设计，用于定性检测待测样品中的腺病毒7型，该LAMP检测引物组包括5条专用引物，即正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、环引物LF。本发明专利技术可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到腺病毒7型，不需要复杂仪器，为腺病毒7型的检测提供了一个新的技术平台，可用于农业生产单位筛查和检测腺病毒7型，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。适于大范围推广应用。适于大范围推广应用。

【技术实现步骤摘要】
腺病毒7型的LAMP检测引物组和检测方法与应用、试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及腺病毒7型的LAMP检测引物组和检测方法与应用、试剂盒。

技术介绍

[0002]腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成，每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100bp的反向重复序列。由于每条DNA链的5'端同相对分子质量为55X103Da的蛋白质分子共价结合，可以出现双链DNA的环状结构。
[0003]人体腺病毒已知有52种，分别命名为adl～ad52，研究最详细的是ad2。腺病毒基因组转录产生mRNA，已知的转录单位至少有5个：EⅠ区位于病毒基因组左侧，可再分成EⅠA和EⅠB，与细胞转化有关；EII区编码DNA结合蛋白，参与病毒的复制；EⅢ区编码出现在宿主细胞表面的一种糖蛋白；EⅣ区位于ad2基因组右端，受EII区编码的DNA结合蛋白质调控；第5个转录单位在病毒感染中期合成ad2蛋白质Ⅳ。
[0004]腺病毒对啮齿类动物有致癌能力，或能转化体外培养的啮齿类动物细胞。使细胞转化只需要腺病毒基因组的一部分，这些基因位于基因组的左端，约占整个基因组的7％～10％。尽管腺病毒分布很广，但对人体不出现致癌性。人体细胞是一类允许细胞(permissive cell)，即这类细胞允许感染入侵的病毒在细胞内复制增殖，最后细胞裂解死亡而释放出大量子代病毒。在体外培养的多种人体肿瘤细胞中均未查出腺病毒颗粒，但在人的1号染色体上有adl2的整合位点，这意味着人体细胞对于腺病毒也可能是非允许细胞，即这类细胞在病毒感染后，病毒不能在细胞内复制增殖，但可整合在受感染细胞的基因组内。这些细胞被病毒转化，表型发生改变，且可在体外无限期地培养传代。
[0005]腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，但一种血清型可引起不同的临床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。
[0006]呼吸道感染的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等，包括以下4种不同的综合征。
[0007]1.急性发热性咽喉炎通常为婴儿和儿童发病，由C组病毒引起，出现咳嗽，鼻塞、发热和咽喉部溃疡等症状，这些表现难以与其他病毒引起的轻型呼吸道感染鉴别。
[0008]2.咽结膜热(pharyngoconjunctival fever)症状与急性发热性咽喉炎相似，但常同时发生结膜炎。咽结膜热有暴发流行倾向，如游泳池结膜炎，多由B组腺病毒3和7型所致，愈后尚好，一般无后遗症。
[0009]3.急性呼吸道疾病(acute respiratory diseases，ARD)这一综合征由咽炎、发热、咳嗽和全身不适为特点，多因突然紧张、劳累、聚集等所致。此感染多由腺病毒4、7型引起，也可见于3型。
[0010]4.肺炎，腺病毒肺炎约占儿童期肺炎的10％，多由腺病毒3、7型引起；在青年人腺
病毒肺炎的病死率为8％～10％；肺炎也是新兵急性呼吸道疾病的一种严重表现。
[0011]环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi(Notomi T,Okayama H,MasubuchiH,et al.Loop
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mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res 2000；28(12):63.)专利技术的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，et al.Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene
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specific loop
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mediated isothermal amplification method.J Virol Methods.2007；141(2):173
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80.)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N,Arai R,Tada S,Taguchi H,Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/Dekkera sp.yeasts with a loop
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mediated isothermal amplification method.Food Microbiol.2007；24(7
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8):778
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85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒(工HHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黄化曲叶病毒等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测腺病毒7型的LAMP专用引物与试剂盒问世。

技术实现思路

[0012]有鉴于此，本专利技术的目的是提供腺病毒7型的LAMP检测引物组和检测方法与应用、试剂盒，可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到腺病毒7型。
[0013]本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题：
[0014]本专利技术的第一方面在于提供了一种腺病毒7型的LAMP检测引物组，所述LAMP检测引物组基于如SEQ ID NO.1所示的腺病毒7型的特异性保守基因序列设计，用于定性检测待测样品中的腺病毒7型。
[0015]结合第一方面，在一些实施方式中，所述LAMP检测引物组包括：
[0016]如SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP；
[0017]如SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP；
[0018]如SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3；
[0019]如SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3；
[0020]以及，如SEQ ID NO.6所示的环引物LF。
[0021]结合第一方面，在一些实施方式中，所述正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、环引物LF的摩尔比为8:8:1:1:4。
[0022]本专利技术的第二方面在于提供了腺病毒7型的LAMP检测方法，包括以下步骤：
[0023]获取待测样本的基因组DNA；
[0024]配制LAMP反应体系本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.腺病毒7型的LAMP检测引物组，其特征在于，所述LAMP检测引物组基于如SEQ ID NO.1所示的腺病毒7型的特异性保守基因序列设计，用于定性检测待测样品中的腺病毒7型。2.根据权利要求1所述的腺病毒7型的LAMP检测引物组，其特征在于，所述LAMP检测引物组包括：如SEQ ID NO.2所示的正向内引物FIP；如SEQ ID NO.3所示的反向内引物BIP；如SEQ ID NO.4所示的正向外引物F3；如SEQ ID NO.5所示的反向外引物B3；以及，如SEQ ID NO.6所示的环引物LF。3.根据权利要求1所述的腺病毒7型的LAMP检测引物组，其特征在于，所述正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3、环引物LF的摩尔比为8:8:1:1:4。4.腺病毒7型的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：获取待测样本的基因组DNA；配制LAMP反应体系，所述LAMP反应体系中包含如权利要求1
‑
3任一项所述的LAMP检测引物组；以待测样本的基因组DNA为模板，在LAMP反应体系中进行LAMP扩增反应，得到反应液；LAMP扩增反应后进行结果判读。5.根据权利要求4所述的腺病毒7型的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP反应体系包括：2μl待测物的基因组DNA，20mM pH为8.8的Tris
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HCl，10mM KC...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘冰，郝永建，高志丹，
申请(专利权)人：中国人民解放军火箭军特色医学中心，
类型：发明
国别省市：