本发明专利技术公开了一种检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法，针对副流感病毒1型、2型和3型的HN基因设计，包括：检测1型的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；检测2型的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；检测3型的上游引物的序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；所有探针的两端分别设有荧光基团和淬灭基团，本发明专利技术实现了对引物探针设计、试剂盒反应体系和扩增程序的优化，有效缩短了检测时间，适用于副流感病毒1/2/3型引起的呼吸道感染的辅助诊断。感染的辅助诊断。感染的辅助诊断。
【技术实现步骤摘要】
检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法
[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法。
技术介绍
[0002]呼吸道感染(Respiratory tract infection，RTI)是人类最常见的一类疾病，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。呼吸道感染引起的临床表现主要为鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎等症状，严重的可引起气管炎、支气管炎及肺炎等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。目前已证明，大部分呼吸道感染是由呼吸道病毒引起的，常见的呼吸道病毒包括副流感病毒、流感病毒、冠状病毒和呼吸道合胞病毒等。
[0003]由于可引发呼吸道感染的病原体种类繁多，患者可能携带不止一种病原体，不同病毒之间、病毒和细菌之间的临床体征和症状相互重叠，往往使得仅基于临床表现的病因诊断变得困难，无法准确确定致病原因，特别是患病幼儿群体，语言发育系统未完善，较难、甚至无法准确描述病痛，可能导致治疗无效，造成抗生素滥用以及医源性交叉感染，因此，对副流感1型、2型及3型进行快速检测及分型，可以帮助诊断和准确用药，具有临床意义。
[0004]实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real
‑
time PCR)是一种实时监控核酸扩增的技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析，利用该技术可以有效对副流感病毒进行检测和分型。但是常规的单重PCR反应，在一个反应管中只能检测单一目标，如需检测多个目标，则需要多种扩增试剂，增加试剂耗材的成本和样本处理时间。
技术实现思路
[0005]针对相关技术中的问题，本专利技术提出一种检测副流感1/2/3型的引物探针组合物、试剂盒及使用方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0007]一种检测副流感1/2/3型的引物探针组合物，针对副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型的HN基因设计，包括：
[0008]检测副流感1型的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；
[0009]检测副流感2型的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；
[0010]检测副流感3型的上游引物的序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；
[0011]所有所述探针的两端分别设有荧光基团和淬灭基团。
[0012][0013]对人的副流感病毒进行分型检测的难度主要在于特异性引物的设计，要在亚型的层级对副流感1/2/3型进行检测区分，对引物的保守性和区别于其他型别的特异性具有非常高的设计要求。本专利技术以副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型的HN基因为靶序列设计上、下游引物和探针，具有良好的特异性，可以有效避免脱靶效应，保证检测结果的准确度，避免出现假阳性或假阴性，可对副流感病毒1型、副流感病毒2型及副流感病毒3型进行有效地检测和分型。
[0014]优选地，所述副流感1型的探针采用SQ双淬灭探针，所述副流感1型的探针5
’
端标记有FAM荧光基团，3
’
端标记有第一个淬灭基团BHQ1，且在第9
‑
10个碱基之间添加第二个淬灭基团BHQ1。
[0015]优选地，所述副流感2型的探针采用SQ双淬灭探针，所述副流感2型的探针5
’
端标记有VIC荧光基团，3
’
端标记有第一个淬灭基团BHQ1，且在第9
‑
10个碱基之间添加第二个淬灭基团BHQ1。
[0016]双淬灭探针(SQ)在常规双标探针5
’
末端携带荧光基团和3
’
端携带淬灭基团的基础上，在探针第9
‑
10个碱基之间添加第二个淬灭基团，以实现最大荧光淬灭效果，降低探针背景荧光，提高探针的荧光增强倍数和灵敏度，优化扩增结果。
[0017]具体地，所述副流感3型的探针5
’
端标记有ROX荧光基团，3
’
端标记有BHQ2淬灭基团，保证在反应过程中可对副流感3型病毒进行区分，提高检测效率。
[0018]优选地，还包括检测内标的上游引物的序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.11所示，探针序列如SEQ ID NO.12所示；
[0019]所述内标的探针5
’
端标记有CY5荧光基团，3
’
端标记有BHQ2淬灭基团；
[0020]所述内标对照为人的核糖核酸酶P的基因片段。所述内标对照能对样本的采集、提取及检测过程进行监控，避免假阴性判读结果的出现。
[0021]本专利技术还涉及一种检测副流感1/2/3型的试剂盒，包括核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照；
[0022]所述核酸扩增反应液包括上述的引物探针组合物。
[0023]本专利技术的试剂盒可以一管多检，同时对副流感病毒1/2/3型和内标进行检测和分型，减少了相关试剂的使用、节省样本处理时间及其他试剂耗材，具有高灵敏性和特异性，缩短了检测时间。
[0024]优选地，所述核酸扩增反应液包括所述引物探针组合物、PCR缓冲液和核苷酸混合液(dNTPs)；
[0025]所述核酸扩增反应液包括以下浓度的组分：
[0026]所述引物探针组合物包括：
[0027]检测副流感1型的所述上游引物0.2
‑
0.5μM，所述下游引物0.2
‑
0.5μM，探针0.05
‑
0.2μM；
[0028]检测副流感2型的所述上游引物0.2
‑
0.5μM，所述下游引物0.2
‑
0.5μM，探针0.05
‑
0.2μM；
[0029]检测副流感3型的所述上游引物0.2
‑
0.5μM，所述下游引物0.2
‑
0.5μM，探针0.05
‑
0.2μM；
[0030]检测内标的所述上游引物0.1
‑
0.3μM，所述下游引物0.1
‑
0.3μM，探针0.05
‑
0.2μM；
[0031]所述PCR缓冲液包括0.1M
‑
0.4M Tris
‑
HCl、20mM
‑
100mM KCl、1.0mM
‑
4.0mM MgCl2及10％
‑
50％甘油；...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种检测副流感1/2/3型的引物探针组合物，其特征在于，针对副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型的HN基因设计，包括：检测副流感1型的上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ IDNO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；检测副流感2型的上游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物的序列如SEQ IDNO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示；检测副流感3型的上游引物的序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的序列如SEQ IDNO.8所示，探针序列如SEQ ID NO.9所示；所有所述探针的两端分别设有荧光基团和淬灭基团。2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述副流感1型的探针采用SQ双淬灭探针，所述副流感1型的探针5
’
端标记有FAM荧光基团，3
’
端标记有第一个淬灭基团BHQ1，且在第9
‑
10个碱基之间添加第二个淬灭基团BHQ1。3.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述副流感2型的探针采用SQ双淬灭探针，所述副流感2型的探针5
’
端标记有VIC荧光基团，3
’
端标记有第一个淬灭基团BHQ1，且在第9
‑
10个碱基之间添加第二个淬灭基团BHQ1。4.根据权利要求1至3任一权利要求所述的引物探针组合物，其特征在于，所述副流感3型的探针5
’
端标记有ROX荧光基团，3
’
端标记有BHQ2淬灭基团。5.根据权利要求1至3任一权利要求所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括检测内标的上游引物的序列如SEQ ID NO.10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.11所示，探针序列如SEQ ID NO.12所示；所述内标的探针5
’
端标记有CY5荧光基团，3
’
端标记有BHQ2淬灭基团；所述内标对照为人的核糖核酸酶P的基因片段。6.一种检测副流感1/2/3型的试剂盒，其特征在于，包括核酸扩增反应液、酶混合液、阳性对照和阴性对照；所述核酸扩增反应液包括权利要求1至5任一权利要求所述的引物探针组合物。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：官丽纯，
申请(专利权)人：广州科方生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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