一种用于人腺病毒核酸检测的引物组、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于人腺病毒检测的引物组、试剂盒及方法，所述引物组包括上游引物、下游引物和探针，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO：3所示。本发明专利技术提供的引物探针组可以覆盖腺病毒全部亚属，可有效避免漏检。本发明专利技术提供的试剂盒含有UNG酶防污染体系，可有效避免因核酸片段污染造成的假阳性。本发明专利技术提供的试剂盒、检测方法具有操作简便、快速、实时等优点，且灵敏度高，特异性好。性好。性好。

【技术实现步骤摘要】
一种用于人腺病毒核酸检测的引物组、试剂盒及方法


[0001]本专利技术公开了一种引物探针组合物、包含试剂盒及其检测方法，属于病毒检测
本专利技术提供的引物探针组合包括针对人腺病毒的特异性引物和探针，采用本专利技术的试剂盒，Q
‑
PCR的方法可以实现对人腺病毒的高特异性、高灵敏度、高效率的检测。

技术介绍

[0002]人腺病毒(human adenovirus，HAdV)是一种无包膜球形DNA病毒颗粒，直径65～90nm，由252个壳粒呈20面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含4.7kb。基于基因组和血清型分析，共A～G 7个亚属，103个类型。其中A、F和G亚属主要引起消化道感染和腹泻，C、E和部分B亚属主要引起呼吸道疾病，其他B亚属主要引起尿路感染，D亚属主要引起角膜炎和结膜炎。
[0003]现有技术中，目前人腺病毒检测的主要方法包括病原体分离培养法、酶联免疫法、胶体金法和分子诊断等方法。病毒分离培养是目前病毒病原学检测的金标准，但是对标本的采集、运输及保存条件要求均较高，且操作复杂、耗时长、不稳定、敏感性不高，不适合临床检测应用；免疫法的特异性高，但灵敏度较低，且往往不可用于疾病的早期诊断；而实时荧光定量PCR技术是目前应用最广泛的分子诊断方法，该技术不仅实现了对核酸模板的定量检测，而且具有灵敏度高、特异性强、自动化程度高的优点。但是，现有用于人腺病毒的试剂盒检测效率及灵敏度低，难以实现滴度微量的病毒检测；且不能覆盖腺病毒全部亚属，容易造成漏检，影响后续疾病的诊断及治疗。CN111549178A公开了一种人类腺病毒通用核酸检测试剂盒及方法，其靶基因序列为人腺病毒hexon基因，但仍存在灵敏度低的缺陷。
[0004]综上，迫切需要开发一种能检测人腺病毒全部亚属、兼顾灵敏度、检测效率的人腺病毒核酸检测的引物组和技术。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术中的上述不足，本专利技术提供了一种用于人腺病毒核酸检测的引物组、试剂盒及方法。本专利技术所提供的引物组可以覆盖腺病毒全部亚属，解决了现有技术中试剂盒覆盖型别少、检测效率低、特异性差以及灵敏度低的问题。
[0006]为了实现上述目的，在本专利技术的第一方面，提供了一种用于人腺病毒核酸检测的引物组，其上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示.
[0007]一种用于人腺病毒核酸检测的探针，其序列如SEQ ID NO：3所示。
[0008]优选地，所述探针的5
’
端和3
’
端分别标记FAM和BHQ1。
[0009]经NCBI比对，本专利技术的靶基因序列为人腺病毒penton基因；可覆盖人腺病毒全部亚属。
[0010]在本专利技术的第二方面，提供了一种用于人腺病毒核酸检测的试剂盒，包括PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和UNG酶，还包括上述的引物组。
[0011]优选地，所述试剂盒还包括阳性质控和阴性质控；所述阳性质控为灭活的含人腺
病毒基因片段的培养物；所述阴性质控为灭活的内标基因片段；所述内标为人β
‑
actin。
[0012]优选地，所述试剂盒还包括用于内标基因片段扩增的上下游引物和用于检测内标的探针；所述用于内标基因片段扩增的上下游引物的序列分别如SEQ ID NO：4和5所示；所述用于检测内标的探针的序列如SEQ ID NO：6所示，所述探针的5
’
端和3
’
端分别标记CY5和BHQ2。
[0013]在本专利技术的第三方面，提供了一种用于人腺病毒核酸检测的PCR扩增反应液，其包括：PCR缓冲液、dNTPs、上述的引物组；所述反应液各组分的配比如下：
[0014][0015]在本专利技术的第四方面，还提供了一种用于人腺病毒核酸检测的方法，将上述PCR反应液、DNA聚合酶和UNG酶按以下反应体系的配比配制成核酸扩增反应混合液进行PCR反应。
[0016]所述引物探针组如前所述；所述反应体系的配比如下：
[0017][0018]所述PCR反应按如下程序进行：
[0019]UNG酶反应：50℃，3～5min
[0020]预变性：95℃，1～3min
[0021][0022]需要说明的是，本专利技术所涉及的核酸检测方法用于非诊疗目的。
[0023]本专利技术所述引物探针序列如下：
[0024]SEQ ID NO:1 5
’‑
CATTACCACCGTCAGTGAAAACG
‑3’
[0025]SEQ ID NO:2 5
’‑
GGCGTCTGGCGTCAGTAA
‑3’
[0026]SEQ ID NO:3 5
’‑
CCTGCTCTCACAGATCACGGGACC
‑3’
[0027]SEQ ID NO:4 5
’‑
ACAGAGCCTCGCCTTTGC
‑3’
[0028]SEQ ID NO:5 5
’‑
CATGCCGGAGCCGTTGTC
‑3’
[0029]SEQ ID NO:6 5
’‑
ATCCGCCGCCCGTCCACA
‑3’
[0030]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0031]本专利技术提供的引物探针组可以覆盖腺病毒全部亚属，可有效避免漏检。
[0032]本专利技术提供的试剂盒含有UNG酶防污染体系，可有效避免因核酸片段污染造成的假阳性。
[0033]本专利技术提供的试剂盒、检测方法具有操作简便、快速、实时等优点，且灵敏度高，特异性好。
附图说明
[0034]图1是不同型别人腺病毒样本的检测结果；
[0035]其中，1号曲线为人腺病毒3型核酸检测扩增曲线，2号曲线为人腺病毒1型核酸检测扩增曲线，3号曲线为人腺病毒4型核酸检测扩增曲线，4号曲线为人腺病毒55型核酸检测扩增曲线，5号曲线为人腺病毒40型核酸检测扩增曲线。
[0036]图2是不同型别人腺病毒样本的检测结果；
[0037]其中，1号曲线为人腺病毒12型核酸检测扩增曲线，2号曲线为人腺病毒8型核酸检测扩增曲线，3号曲线为人腺病毒52型核酸检测扩增曲线。
[0038]图3是本专利技术提供的人腺病毒核酸检测方法的特异性检测结果；
[0039]其中，1号曲线为人腺病毒，2号曲线为甲型流感病毒H1N1型、乙型流感病毒Victoria型、呼吸道合胞病毒A型、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、干酪乳杆菌。
[0040]图4是本专利技术提供的人腺病毒核酸检测方法对不同浓度1型人腺病毒的检测结果；
[0041]其中，1号曲线、2号曲线、3号曲线、4号曲线分别本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于人腺病毒核酸检测的引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示。2.一种用于人腺病毒核酸检测的探针，其特征在于，所述探针的序列如SEQ ID NO：3所示。3.根据权利要求2所述的一种用于人腺病毒核酸检测的探针，其特征在于，所述探针的5
’
端和3
’
端分别标记FAM和BHQ1。4.一种用于人腺病毒核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和UNG酶，还包括权利要求1所述的引物以及权利要求2
‑
3任一项所述的探针。5.根据权利要求4所述的一种用于人腺病毒核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控和阴性质控；所述阳性质控为灭活的含人腺病毒基因片段的培养物；所述阴性质控为灭活的内标基因片段；所述内标为人β
‑
actin。6.根据权利要求5所述的一种用于人腺病毒核酸检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于内标片段扩增的上下游引...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娇娇，
申请(专利权)人：广州科方生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：