一种用于miRNA检测的dT引物、试剂盒及检测方法技术

技术编号:37960591 阅读:10 留言:0更新日期:2023-06-30 09:35
本发明专利技术公开了一种用于miRNA检测的dT引物、试剂盒及检测方法,所述dT引物在5

【技术实现步骤摘要】
一种用于miRNA检测的dT引物、试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
,特别是涉及一种用于miRNA检测的dT引物、试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]Micro RNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的非编码单链小分子RNA,广泛参与了生命活动各个层次的调节,包括胚胎发育、器官形成、细胞增殖、细胞凋亡、细胞应激应答、干细胞分化,内分泌调控、免疫调节和疾病的发生与发展。其通过与靶mRNA3

非编码区(3

UTR)的特异性结合,降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译,最终导致靶基因的蛋白质合成减少。大量的研究结果表明,恶性肿瘤等重大疾病的发生和发展与人体内miRNAs的异常表达有密切关系,这就意味着miRNAs将有巨大的潜力成为新的生物标志物,可用于癌症等重大疾病的早期诊断,可作为新的基因药物作用靶点。
[0003]miRNA检测方法大致分为探针杂交法和实时定量PCR(quantitative Real

Time PCR)法两类。基于探针杂交法主要有Northern blot技术、生物芯片技术、基于微球的流式细胞术。这些技术的原理是将探针与RNA样品进行杂交,然后进行信号检测。Northern blot技术作为检测RNA的经典方法,常用来评价其它方法的可靠性;但这种技术对样品要求量大,操作相对费时费力,不适合高通量分析。生物芯片技术能实现miRNA的高通量分析,即在一块芯片上同时检测多个miRNA;但缺点是结果准确性低,重复性差,实验价格昂贵。基于微球的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中,更有利于捕获miRNA序列,提高了准确性;但该技术须使用特殊的流式细胞仪和微球,实验成本高,同样不利于推广。
[0004]相比探针杂交法,实时定量PCR(quantitative Real

Time PCR)技术检测miRNA的表达是当前miRNA研究中最为常用的技术手段之一。基于real

time RT

PCR的miRNA检测方法主要包括茎环引物(Stem loop)法和poly(A)聚合酶加尾法两种。
[0005]茎环引物法使用3

端有6个碱基与miRNA互补配对的引物来进行miRNA的反转录,同时反转录引物的5

端含有一个茎环结构,能增强miRNA和DNA异质双链的亲合力,特异性高,通过特异性正、反向引物、探针实现miRNA的qPCR检测。但由于特异性探针的使用使得颈环法的成本大大提高,对于高通量的miRNAs分析来说过于昂贵。
[0006]poly(A)聚合酶加尾法是先用poly(A)聚合酶使miRNA的3

端带上一段poly(A)尾巴,然后用5

端含有接头序列的Oligo(dT)引物进行反转录,完成cDNA合成。利用一条miRNA序列特异的正向引物即可实现PCR扩增。该方法的优点是简便、快速,反转录引物对miRNA具有通用性,因此检测成本较低;但由于Poly(A)聚合酶对RNA无差别添加Ploy(A)尾巴,逆转录引物也无特异性,直接导致加尾法检测结果可能为pre

miRNA和成熟miRNA的总和,降低了检测的特异性和灵敏性。
[0007]CN102154505A公开了一种检测miRNA的方法及其应用,使用由特异碱基和Oligo(dT)组成的反转录引物对样品中miRNA进行反转录,然后用特异上游引物、通用下游引物和通用探针对miRNA进行real

time PCR定量检测。此方法虽可特异性检测miRNA分子,但和茎
环引物法一样,不能实现一次反转录获得全部miRNAs分子的cDNA产物。每种miRNA分子检测都需要单独设计特异性的反转录引物,且特异性探针的使用使得成本较高。

技术实现思路

[0008]鉴于上述问题,本专利技术提供了一种用于miRNA检测的dT引物、试剂盒及检测方法。通过提升线性通用反转录引物及检测引物的特异性,同时兼具降低成本及实用性,以检测、定量和分析miRNA的表现量。
[0009]为了实现上述目的,在本专利技术的第一方面,提供了一种用于miRNA检测的dT引物,其在5

至3

方向上由4个片段组成,分别为:反转录起始序列、通用短链引物Universal PCR Primer R序列、28个oligo(dT)序列和识别miRNA的3

端2个简并碱基序列。
[0010]在本专利技术中,2个碱并碱基设计可有效识别所有的micro RNA分子的3

端起始序列,能有效控制反转录合成的cDNA长度,以及cDNA纯度。纯度较高的cDNA模板能增加检测结果的准确性和特异性。
[0011]优选地,所述dT引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]优选地,所述反转录特异性的长链dT引物长度为50

60个碱基;所述通用短链检测引物Universal PCR Primer R的长度为20个碱基,TM值为55

65℃之间。
[0013]在本专利技术的第二方面,提供了一种用于miRNA检测的试剂盒,包含上所述的dT引物。
[0014]优选地,还包括miRNA反转录反应混合液,cDNA扩增反应混合液。
[0015]优选地,所述miRNA反转录反应混合液包括2*miRNAbuffer,E.coli Poly(A)Polymerase酶,Reverse Transcriptase酶,dNTP Mix。
[0016]优选地,所述cDNA扩增反应混合液包括2*miRNAqPCR buffer,UDG酶,Taq酶,dNTPs,SYBR Green染料,通用短链引物Universal PCR Primer R,特异性短链检测引物Forward U6Primer F。
[0017]在本专利技术中,特异性短链引物Forward Primer是待测miRNA的5

端起始的16

20个碱基相同的序列和特定的4个碱基。通用短链引物Universal PCR Primer R与特异性长链引物序列的一部分序列相同。
[0018]优选地,所述通用短链引物Universal PCR Primer R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述特异性短链检测引物Forward U6 Primer F的长度为18

25个碱基,TM值为55

65℃之间,核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0019]更为优选地,所述cDNA扩增反应混合液的配比如下:2*miRNA qPCR buffer 10ul;UDG酶0.1U

1U;Taq酶1

5U;dN本文档来自技高网
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于miRNA检测的dT引物,其特征在于,在5

至3

方向上由4个片段组成,分别为:反转录起始序列、通用短链引物Universal PCR Primer R序列、28个oligo(dT)序列和识别miRNA3

端的2个简并碱基序列。2.根据权利要求1所述的dT引物,其特征在于,所述dT引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述的dT引物,其特征在于,所述反转录特异性的长链dT引物长度为50

60个碱基;所述通用短链检测引物Universal PCR Primer R的长度为20个碱基,TM值为55

65℃之间。4.一种用于miRNA检测的试剂盒,其特征在于,包含权利要求1

3任一项所述的dT引物。5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,还包括miRNA反转录反应混合液,cDNA扩增反应混合液。6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述miRNA反转录反应混合液包括2*miRNAbuffer,E.coli Poly(A)Polymerase酶,Reverse Transcriptase酶,dNTP Mix。7.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述cDNA扩...

【专利技术属性】
技术研发人员:朱锋梁思敏
申请(专利权)人:广州科方生物技术股份有限公司
类型:发明
国别省市:

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1