同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT

【技术实现步骤摘要】
同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT
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qPCR试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种同时检测猫冠状病毒（FCoV）、猫细小病毒（FPV）和猫白血病病毒（FeLV）的多重RT
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qPCR试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)是一种有包膜的、不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目冠状病毒科冠状病毒亚科中的甲型冠状病毒属。FCoV包括猫肠道冠状病毒（FECV）和猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）两种生物型，根据编码刺突蛋白的S基因核苷酸序列的差异，FCoV可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种血清型。FECV主要引起轻度到重度肠炎，FIPV主要引起感染猫腹膜炎、眼膜炎及神经症状等，临床病例多为渗出性FIP，以体腔积液、浆膜炎为显着病理改变。FCoV在猫群中的携带率超过20%。
[0003]猫细小病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性肠炎病毒或猫瘟病毒。FPV属于细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属，是一种小的单链无囊膜DNA病毒。猫瘟是一种以白细胞减少和出血性胃肠炎为特征的高致病性传染病，是一种侵害猫科动物的重要病原体，幼龄动物更易感，具有分布广、变异较快的特点，易感动物的发病率和死亡率高达25%～90%。
[0004]猫白血病病毒（Feline leukemia virus，FeLV）属于逆转录病毒科γ逆转录病毒属成员，基因组为单股正链线状RNA二聚体，于1964年首次从猫的淋巴细胞瘤中分离出来。FeLV可引起猫多种类型的白血病和其他疾病如淋巴细胞、成红细胞、骨髓细胞的增生或减少，以及肠炎、流产等疾病。
[0005]FCoV、FPV和FeLV三种病毒在猫群中的携带率都较高，而且存在同时携带多种病毒的情况，并且三种病毒的表现存在一定的相似性，使得区分三种病毒的难度增加。虽然目前已经报道了几种能够单独检测FCoV、FPV、FeLV的qPCR方法，但是仍然缺少能够快速有效的同时检测猫冠状病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒的检测方法，无法满足实验室对于三种病毒的定性定量分析和研究。

技术实现思路

[0006]针对上述不足，本专利技术公开了一种同时检测猫冠状病毒（FCoV）、猫细小病毒（FPV）和猫白血病病毒（FeLV）的多重RT
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qPCR试剂盒及检测方法，实现了对三种病毒的快速、准确的检测，为实验室检测区分上述病毒提供了有效的技术手段。
[0007]本专利技术是采用如下技术方案实现的：一种同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT
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qPCR试剂盒，其包括以下引物和探针：引物F1的序列为CCTGTTTGGTAAGTCGTCTAGTAT（序列表SEQ ID NO.1）；引物R1的序列为CGAGGATCTTAAATTGTTTGGAACT（序列表SEQ ID NO.2）；探针A的序列为FAM
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TAGTTGGGTAGACCGGGTTCCGTC
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BHQ1（序列表SEQ ID NO.3）；引物F2的序列为GCTACTCAGCCACCAACTAAA（序列表SEQ ID NO.4）；
引物R2的序列为TCATAGCTGCTGGAGTAAATGG（序列表SEQ ID NO.5）；探针B的序列为CY5
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ACTGCATCATTGATGGTTGCATTAG
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BHQ3（序列表SEQ ID NO.6）；引物F3的序列为CCCATCCAGGCAATCTCAAATA（序列表SEQ ID NO.7）；引物R3的序列为GCAATGGAGGCATTAACAAGAG（序列表SEQ ID NO.8）；探针C的序列为VIC
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TAACACCTCACCATTCCCAAGGCA
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BHQ1（序列表SEQ ID NO.9）。
[0008]所述引物F1、引物R1和探针A是用于检测FCoV中的5
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UTR基因；所述引物F2、引物R2和探针B是用于检测FPV中的VP2基因；所述引物F3、引物R3和探针C是用于检测FeLV中的env基因。
[0009]一种同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT
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qPCR检测方法，其用于非疾病诊断和治疗目的，具体包括以下步骤：（1）样品处理：采用核酸提取试剂盒对待测样品进行提取得到总DNA/RNA；所述待测样品包括猫的鼻拭子、肛拭子、腹水、粪便中的任意一种；（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总DNA/RNA作为模板进行qRT
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PCR扩增反应，采用如SEQ ID NO.1～NO.9所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为20μL，其包括以下体积的组分：10μL的2
×
One Step RT
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PCR Buffer，0.4μL的TaKaRa Ex Taq HS，0.4μL的PrimeScript RT Enzyme Mix II，2μL的模板，引物F1、引物R1、探针A、引物F2、引物R2、探针B、引物F3、引物R3和探针C各0.3μL，余量为无核酸酶水；所述引物R1、探针A、引物F2、引物R2、探针B、引物F3、引物R3和探针C的浓度均为20 pmol/μL；（3）qRT
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PCR扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：Step1：42℃反转录5min；Step2：95℃预变性10s；Step3：95℃变性5s，55℃退火30s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；（4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线，读取相应的Ct值并进行结果判定。
[0010]进一步的，在步骤（1）中，将1mL 的pH 为7.2的 PBS液加入至灭菌离心管中，接着加入所述待测样品，然后反复震荡1min后，再在5000 r/min的条件下离心10 min，接着取上清液,并按照核酸提取试剂盒提取得到总RNA/DNA，然后于
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80℃保存备用。
[0011]进一步的，在步骤（4）中，当所得到的Ct值小于等于38个周期时，判定为阳性，当Ct值大于38个周期时，判定为阴性。
[0012]本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：猫冠状病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒存在一种或多种混合感染情况。本专利技术针对FCoV的5
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UTR基因，FPV的VP2基因，FeLV的env基因设计了三对特异性引物和相应的探针，并开发了一种基于TaqMan探针的多重RT
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qPCR检测方法，能够同时检测上述三种病毒。该方法只能检测出猫冠状病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒的核酸，与猫和犬的其他病毒无交叉反应；只需一次实时荧光PCR反应即可同时检测三个病毒，大幅减少检测时间，提高检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT
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qPCR试剂盒，其特征在于：包括以下引物和探针：引物F1的序列为CCTGTTTGGTAAGTCGTCTAGTAT；引物R1的序列为CGAGGATCTTAAATTGTTTGGAACT；探针A的序列为FAM
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TAGTTGGGTAGACCGGGTTCCGTC
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BHQ1；引物F2的序列为GCTACTCAGCCACCAACTAAA；引物R2的序列为TCATAGCTGCTGGAGTAAATGG；探针B的序列为CY5
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ACTGCATCATTGATGGTTGCATTAG
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BHQ3；引物F3的序列为CCCATCCAGGCAATCTCAAATA；引物R3的序列为GCAATGGAGGCATTAACAAGAG；探针C的序列为VIC
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TAACACCTCACCATTCCCAAGGCA
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BHQ1。2.一种同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT
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qPCR检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其特征在于：包括以下步骤：（1）样品处理：采用核酸提取试剂盒对待测样品进行提取得到总DNA/RNA；所述待测样品包括猫的鼻拭子、肛拭子、腹水、粪便中的任意一种；（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总DNA/RNA作为模板进行qRT
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PCR扩增反应，采用如SEQ ID NO.1～NO.9所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为20μL，其包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：施开创，冯淑萍，龙凤，尹彦文，黄美芝，霍秀龙，李凤梅，屈素洁，陆文俊，
申请(专利权)人：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心广西壮族自治区屠宰技术中心，
类型：发明
国别省市：