PEAV的RAA-CRISPR/Cas12a检测组合物、反应装置、试纸条及试剂盒制造方法及图纸

本发明专利技术公开了PEAV的RAA

【技术实现步骤摘要】
PEAV的RAA
‑
CRISPR/Cas12a检测组合物、反应装置、试纸条及试剂盒


[0001]本专利技术是关于动物疫病检测的
，特别是关于一种PEAV的RAA
‑
CRISPR/Cas12a检测组合物、反应装置、试纸条及试剂盒。

技术介绍

[0002]2017年我国广东省某养猪场的新生仔猪暴发严重的腹泻疫情，患病仔猪出现剧烈腹泻、呕吐和脱水等主要临床症状，5日龄以内仔猪的死亡率高达90％，哺乳母猪也出现腹泻症状；最终，科研人员从腹泻仔猪的小肠样本中首次分离出一种全新的猪肠道冠状病毒，并将其命名为猪肠道甲型(α)冠状病毒(Porcine Enteric Alphacoronavirus，PEAV)。PEAV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，在分类上属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α冠状病毒属(Alphacoronavirus)成员。PEAV基因组全长27kb左右，除5
’
端和3
’
端的非翻译区(Untranslated region，UTR)外，从5
’
端到3
’
端依次为开放阅读框(ORF)1a和1b、纤突蛋白基因(S)、辅助蛋白基因ORF3、囊膜蛋白基因(E)、膜蛋白基因(M)、核衣壳蛋白基因(N)以及辅助蛋白基因NS7a和NS7b。PEAV具有潜在的人兽共患风险。
[0003]作为一种新发猪肠道致病性冠状病毒，PEAV的暴发与传播已经给我国养猪业造成了较大的经济损失。由于PEAV感染猪的主要临床症状与猪流行性腹泻和猪丁型冠状病毒感染等重要猪腹泻病十分相似，且难以区分。因此，研发快速可靠的检测方法对于控制PEAV的进一步传播与流行至关重要。目前，多种分子生物学和血清学检测方法已被建立并应用于PEAV的诊断与检测，包括基于TaqMan探针的实时RT
‑
PCR、微滴式数字PCR、重组酶聚合酶扩增(RPA)、实时荧光逆转录环介导等温扩增(RT
‑
LAMP)、微流控RT
‑
LAMP芯片以及间接ELISA等。尽管上述检测方法在PEAV的检测与诊断中发挥了重要作用，但均普遍存在操作复杂、检测时间偏长、过度依赖昂贵仪器设备和娴熟的技术人员等不足，难以满足临床上对PEAV感染猪进行现场快速和可视化检测的实际需求以及流行病学调查的需要，而且也难以在资源有限的实验室中进行推广使用。
[0004]近年来，CRISPR/Cas系统已被逐渐开发成为一种高效的基因编辑技术和新一代的核酸分子检测技术。然而，仅仅依靠CRISPR/Cas12a系统进行核酸检测通常难以达到非常高的检测灵敏度、且检测时间偏长，为此需要在CRISPR/Cas12a检测前先对靶基因片段进行快速扩增富集。近来研究发现，CRISPR/Cas12a与RAA等温扩增具有良好的技术互补性，RAA扩增可显著提高CRISPR/Cas12a的检测灵敏度，而CRISPR/Cas12a技术能够进一步提高RAA扩增的特异性。自核酸等温扩增与CRISPR/Cas12a系统相结合以来，该联合技术以其极高的灵敏度、特异性和便捷性而闻名于世，已成为病原体核酸和相关疾病基因检测的有力工具。目前，RAA
‑
CRISPR/Cas12a技术已成功应用于严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
‑
CoV
‑
2)、非洲猪瘟病毒(ASFV)等重要病原体的检测。然而，上述病原体的RAA
‑
CRISPR/Cas12a检测方法通常采用两步法，即先对病原体核酸进行RAA扩增，然后开盖向扩增子中添加CRISPR/Cas12a试剂进行酶切反应，RAA扩增和CRISPR/Cas12a反应的简单混合通常会导致检测灵敏
度的急剧下降，其主要原因是模板DNA或RAA扩增子会激活Cas12a酶的顺式切割活性，导致模板和扩增子被顺式切割失效；与此同时被激活的Cas12a“附属切割”活性会切割单链引物，造成RAA扩增效率急剧下降。因此，通常需要将该系统中的RAA扩增和CRISPR/Cas12a信号检测分开进行，但是分步进行一方面增加了操作的复杂性，使整个检测时间延长，另一方面开盖操作极易造成气溶胶污染，不利于临床应用。
[0005]公开于该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供PEAV的RAA
‑
CRISPR/Cas12a检测组合物、反应装置、试纸条及试剂盒，其能够解决PEAV现有检测检测方法存在的操作复杂和检测时间长的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种PEAV的RAA
‑
CRISPR/Cas12a检测组合物，包括引物对、向导RNA和探针，所述引物对为用于检测PEAV N基因的上游引物PEAV
‑
N
‑
F和下游引物PEAV
‑
N
‑
R，所述向导RNA为PEAV
‑
N
‑
gRNA，所述探针包括荧光淬灭探针或荧光生物素探针，序列如下：
[0008]上游引物PEAV
‑
N
‑
F：5
’‑
AGTCACCTATCACTATGTAATGAAGGTCCCC
‑3’
(SEQ ID NO.1)；
[0009]下游引物PEAV
‑
N
‑
R：5
’‑
TAATTAATAATCTCATCCACCATCTCAACCT
‑3’
(SEQ ID NO.2)；
[0010]向导RNA(PEAV
‑
N
‑
gRNA)：5
’‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGAGCAAGUCUCGGCUUAC
‑3’
(SEQ ID NO.3)；
[0011]荧光淬灭探针ssDNA probe 1：5
’‑
FAM
‑
TTATTATT
‑
BHQ1
‑3’
；或者
[0012]荧光生物素探针ssDNA probe 2：5
’‑
FAM
‑
TTATTATT
‑
Biotin
‑3’
；
[0013]所述荧光淬灭探针自5
’
端起第1位碱基T标记FAM发光基团，第8位碱基T标记BHQ1淬灭基团；所述荧光生物素探针自5
’
端起第1位碱基T标记FAM发光基团，第8位碱基T进行生物素(Biotin)修饰。
[0014]本专利技术还提供一种PEAV的RAA
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PEAV的RAA
‑
CRISPR/Cas12a检测组合物，其特征在于，包括引物对、向导RNA和探针，所述引物对为用于检测PEAV N基因的上游引物PEAV
‑
N
‑
F和下游引物PEAV
‑
N
‑
R，所述向导RNA为PEAV
‑
N
‑
gRNA，所述探针包括荧光淬灭探针ssDNA probe 1或荧光生物素探针ssDNA probe 2，序列如下：上游引物PEAV
‑
N
‑
F：5
’‑
AGTCACCTATCACTATGTAATGAAGGTCCCC
‑3’
(SEQ ID NO.1)；下游引物PEAV
‑
N
‑
R：5
’‑
TAATTAATAATCTCATCCACCATCTCAACCT
‑3’
(SEQ ID NO.2)；PEAV
‑
N
‑
gRNA：5
’‑
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGAGCAAGUCUCGGCUUAC
‑3’
(SEQ ID NO.3)；荧光淬灭探针ssDNA probe 1：5
’‑
FAM
‑
TTATTATT
‑
BHQ1
‑3’
；或者荧光生物素探针ssDNA probe 2：5
’‑
FAM
‑
TTATTATT
‑
Biotin
‑3’
；所述荧光淬灭探针自5
’
端起第1位碱基T标记FAM发光基团，第8位碱基T标记BHQ1淬灭基团；所述荧光生物素探针自5
’
端起第1位碱基T标记FAM发光基团，第8位碱基T进行Biotin修饰。2.PEAV的RAA
‑
CRISPR/Cas12a检测反应装置，其特征在于，包括外套管和内套管，所述内套管位于所述外套管内部，所述外套管用于添加RAA反应体系，所述内套管用于添加CRISPR/Cas12a酶切体系，通过涡旋能够将所述内套管内CRISPR/Cas12a反应体系释放到所述外套管中。3.PEAV的RAA
‑
CRISPR/Cas12a检测的荧光法试剂盒，其特征在于，内置权利要求2所述的PEAV的RAA
‑
CRISPR/Cas12a检测反应装置，所述荧光法试剂盒的总反应体系包括25μL RT
‑
RAA扩增体系和20μL CRISPR/Cas12a酶切体系；所述RT
‑
RAA扩增体系包括反应缓冲液A14.70μL、反应缓冲液B1.25μL、10pmol/μL上游引物PEAV
‑
N
‑
F(SEQ ID NO.1)1.00μL、10pmol/μL下游引物PEAV
‑
N
‑
R(SEQ ID NO.2)1.00μL、待测样品RNA模板1.00μL和无核酸酶双蒸水6.05μL；，所述反应缓冲液A由100U/μL逆转录酶、120ng/μL重组酶、30ng/μL DNA聚合酶、800ng/μL单链DNA结合蛋白组成，所述反应缓冲液B为280mM醋酸镁；所述CRISPR/...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永宁，王文龙，周磊，盖新娜，韩军，郭鑫，杨汉春，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：