同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针组合物、检测方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术属于病毒检测技术领域，具体提供了一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针组合物，包括检测小鼠微小病毒的引物和探针，检测小鼠胸腺病毒的引物和探针。本发明专利技术还提供了包括上述引物及探针组合物的试剂盒，以及同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的方法。本发明专利技术提供的这种引物及探针组合物、试剂盒及方法可以特异性扩增出MVM和MTLV这两种病毒，且不与其它病毒核酸发生交叉反应，也不会与样本中可能存在的各种常用细胞系基因组发生交叉反应，特异性良好、敏感性高、重复性好，弥补了现有技术中小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒必须分别进行检测的短板，为啮齿类动物生物制品的外源病毒污染防控提供了良好的检测手段。检测手段。检测手段。

【技术实现步骤摘要】
同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针组合物、检测方法、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于病毒检测
，涉及同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物和探针组合物及其应用，具体涉及一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的双重荧光定量QPCR检测引物和探针组合物、检测方法、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]随着重组蛋白类药物在医疗领域的广泛应用，生物制品的病毒安全问题也备受重视，啮齿类动物细胞系如中国仓鼠卵巢细胞系(CHO
‑
K1细胞)常用于蛋白质表达生产系统，以保证产品的正确构象和活性，然而无论是生物活性原材料还是复杂的生产操作过程，都不可避免地存在病毒污染的风险。
[0003]小鼠微小病毒(murine minute virus，MVM)为单链DNA病毒，无囊膜，有极强的稳定性，易感染啮齿类动物细胞，如CHO
‑
K1、BHK21细胞等。小鼠胸腺病毒Thymic Virus(MTLV；murid herpesvirus 3)属于疱疹病毒科，病毒颗粒直径约为135nm，是一种含包膜的DNA病毒，可感染并杀死新生小鼠胸腺内发育中的T淋巴细胞，属于一种实验动物易感病原体。ICH Q5A明确规定，MVM和MTLV作为啮齿类动物细胞系中的物种特异性病毒，需要进行外源因子污染检测。常用于MVM和MTLV的检测方法为病毒分离、ELISA抗原检测、RT
‑
PCR核酸检测，相比之下荧光定量QPCR检测方法更直观、快速，适合早期病毒安全风险把控。/>[0004]目前样本中的小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒必须分别进行两个荧光定量QPCR检测，检测过程费工费时的技术，且市面上缺乏可同时检测MVM和MTLV的检测方法和试剂盒，为此，本专利技术提供了一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的双重荧光定量QPCR检测引物和探针组合物、检测方法、试剂盒，解决了检测过程费工费时的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术中小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒必须分别进行检测的问题。
[0006]为此，本专利技术提供了一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针组合物，包括检测小鼠微小病毒的上游引物P
‑
MVM
‑
F、下游引物P
‑
MVM
‑
R和探针MVM
‑
P，检测小鼠胸腺病毒的上游引物P
‑
MTLV
‑
F、下游引物P
‑
MTLV
‑
R和探针MTLV
‑
P；
[0007]所述上游引物P
‑
MVM
‑
F的序列为5
’‑
AACTTACTTCTTCTGCTGCACA
‑3’
；
[0008]所述下游引物P
‑
MVM
‑
R的序列为5
’‑
AGACCCAGTAGAAACACCAA CC
‑3’
；
[0009]所述探针MVM
‑
P的序列为5
’‑
(FAM)
‑
CCAACCTGA/iXNA_C/RGC GRAAACG
‑
(BHQ)
‑3’
；
[0010]所述上游引物P
‑
MTLV
‑
F的序列为5
’‑
AGGACTTGCTTTACCTGTTG
‑3’
；
[0011]所述下游引物P
‑
MTLV
‑
R的序列为5
’‑
ATACATACCTCTCCAAGAACC G
‑3’
；
[0012]所述探针MTLV
‑
P的序列为5
’‑
(FAM)
‑
CCAACCTGA/iXNA_C/RGC GRAAACG
‑
(BHQ)
‑3’
；
[0013]其中/iXNA_A/表示对碱基A进行锁核酸修饰；/iXNA_T/表示对碱基T进行锁核酸修
饰；/iXNA_G/表示对碱基G进行锁核酸修饰；/iXNA_C/表示对碱基C进行锁核酸修饰。
[0014]具体的，上述引物及探针组合物还包括用于检测小鼠胸腺病毒的探针MTLV
‑
P2；所述所述探针MTLV
‑
P2的序列为5
’‑
(HEX)
‑
TACATTCC/iX NA_C/G/iXNA_C/T/iXNA_T/CAAAC
‑
(BHQ)
‑3’
；
[0015]其中/iXNA_T/表示对碱基T进行锁核酸修饰；/iXNA_C/表示对碱基C进行锁核酸修饰。
[0016]本专利技术还提供了一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物及探针组合物，且所述上游引物P
‑
MVM
‑
F、所述下游引物P
‑
MVM
‑
R、所述上游引物P
‑
MTLV
‑
F和所述下游引物P
‑
MTLV
‑
R混合后形成混合引物，所述探针MVM
‑
P和所述探针MTLV
‑
P混合后形成混合探针。优选的，混合探针中还包括探针MTLV
‑
P2。
[0017]具体的，上述混合引物中上游引物P
‑
MVM
‑
F的浓度为0.1
‑
1mM，下游引物P
‑
MVM
‑
R的浓度为0.1
‑
1mM，上游引物P
‑
MTLV
‑
F的浓度为0.1
‑
1mM，下游引物P
‑
MTLV
‑
R的浓度为0.1
‑
1mM。
[0018]具体的，上述混合探针中探针MVM
‑
P的浓度为0.05
‑
1mM，探针MTLV
‑
P的浓度为0.05
‑
1mM。优选的，探针MTLV
‑
P2的浓度为0.05
‑
1mM。
[0019]具体的，上述试剂盒还包括QPCR反应预混液；所述QPCR反应预混液包含探针法荧光定量专用预混液AceQ Universal U+Probe Master Mix V2和Mg
2+
。
[0020]具体的，上述试剂盒还包括定量标准品；所述定量标准品为PUC57
‑
MVM和PUC57
‑
MTLV质粒混合物。
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针组合物，包括检测小鼠微小病毒的上游引物P
‑
MVM
‑
F、下游引物P
‑
MVM
‑
R和探针MVM
‑
P，检测小鼠胸腺病毒的上游引物P
‑
MTLV
‑
F、下游引物P
‑
MTLV
‑
R和探针MTLV
‑
P，其特征在于：所述上游引物P
‑
MVM
‑
F的序列为5
’‑
AACTTACTTCTTCTGCTGCACA
‑3’
；所述下游引物P
‑
MVM
‑
R的序列为5
’‑
AGACCCAGTAGAAACACCAA CC
‑3’
；所述探针MVM
‑
P的序列为5
’‑
(FAM)
‑
CCAACCTGA/iXNA_C/RGC GRAAACG
‑
(BHQ)
‑3’
；所述上游引物P
‑
MTLV
‑
F的序列为5
’‑
AGGACTTGCTTTACCTGTTG
‑3’
；所述下游引物P
‑
MTLV
‑
R的序列为5
’‑
ATACATACCTCTCCAAGAACC G
‑3’
；所述探针MTLV
‑
P的序列为5
’‑
(FAM)
‑
CCAACCTGA/iXNA_C/RGC GRAAACG
‑
(BHQ)
‑3’
；其中/iXNA_A/表示对碱基A进行锁核酸修饰；/iXNA_T/表示对碱基T进行锁核酸修饰；/iXNA_G/表示对碱基G进行锁核酸修饰；/iXNA_C/表示对碱基C进行锁核酸修饰。2.如权利要求1所述的同时检测小鼠微小病毒和小鼠胸腺病毒的引物及探针组合物，其特征在于：还包括探针MTLV
‑
P2；所述探针MTLV
‑
P2的序列为5
’‑
(HEX)
‑
TACATTCC/iXNA_C/G/iXNA_C/...

【专利技术属性】
技术研发人员：张若璇，王明珍，徐国东，袁冰，郝瑶，韩玲玲，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：