一种用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针及其应用制造技术

本发明专利技术属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针及其应用。RAA引物对包括如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物和如SEQ ID NO.2所示序列的下游引物，探针包括如SEQ ID NO.3所示序列。使用该用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针对非洲猪瘟病毒进行检测，可以在10min

【技术实现步骤摘要】
一种用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针及其应用


[0001]本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针及其应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种高度致死性的出血性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将ASF列为法定报告的传染病。Montgomery等(1921)首次报道在肯尼亚发生了非洲猪瘟，随后该病在非洲其他国家迅速传播。1957年，非洲猪瘟传到了葡萄牙，继而在欧洲其他国家、南美洲部分国家和高加索地区等地流行。2018年，我国沈阳首次暴发非洲猪瘟，随后在国内多个地区流行，造成大量猪死亡，给我国养猪业造成巨大的经济损失。目前尚无商业化疫苗和药物用于预防和治疗ASF，严格检疫、监测、及时清除感染猪，或对疑似病例进行确诊是有效预防和控制非洲猪瘟蔓延、降低其造成的损失的主要措施。即加强对ASFV检测技术的研究，对于保障养猪业的健康发展及国际间生猪产品贸易往来至关重要。
[0003]ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，具有多层囊膜，病毒粒子呈二十面体对称。基因组双链DNA长170
‑
194kb，包含151～167个开放阅读框(Open reading frame,ORF)，至少编码68种结构蛋白，其中编码病毒衣壳蛋白p72的B646L基因具有高度保守性，故B646L基因常作为ASFV核酸检测的靶基因。迄今，根据B646L基因可将全球流行的ASFV分为24个基因型。已知不同分离株的毒力不同，加之病毒感染途径及剂量存在差异(有的病猪的临床症状与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪皮炎肾病综合征、猪丹毒、沙门氏菌病或猪链球菌病相似)，导致ASF的临床症状复杂；另外，ASFV毒株不断复杂化，出现了不同基因或基因片段缺失的毒株，这些毒株的毒力弱或较低，感染猪的潜伏期长，排毒不规律，临床症状不典型或多样化。所以仅仅凭借临床诊断很难确诊，需要对ASFV病毒进行直接检测。
[0004]目前用于检测ASFV的常用方法主要包括：病毒分离和红细胞吸附试验、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)或实时荧光定量PCR(Real
‑
time fluorescence quantitative PCR,qPCR)、间接免疫荧光实验以及酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等方法。但是PCR需要特殊的热循环仪，以满足体外扩增核酸过程中必须的DNA变性、复性和延伸的特殊需要；另外，由于病毒感染早期抗体水平低，尤其是低毒力毒株感染后抗体产生较晚，所以ELISA不适合感染的早期检测与诊断，并且耗时长。即目前这些方法各有特点，但需要特殊的仪器设备，耗时长，不适合现场快速检测与诊断。
[0005]因此，建立一种耗时短，不需要特殊仪器设备，适合现场快速检测的检测ASF的方法具有重大意义。

技术实现思路

[0006]针对以上问题，本专利技术目的之一在于提供一种适用于ASFV现场快速检测的方法，
其是基于RAA引物对及探针的一种RAA检测ASFV的方法，该方法可以在10min
‑
20min内完成对ASFV的扩增，在15min
‑
25min内(扩增+显色)完成对ASF的检测，且不需要特殊仪器设备。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术可以采用以下技术方案：
[0008]本专利技术一方面提供一种用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针，其中，RAA引物对包括如SEQ ID NO.1所示序列的上游引物和如SEQ ID NO.2所示序列的下游引物，探针包括如SEQ ID NO.3所示序列。
[0009]本专利技术另一方面提供一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，其包括上述的用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针。
[0010]本专利技术再一方面提供一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂盒，其包括上述用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针，或上述用于非洲猪瘟病毒检测的试剂。
[0011]本专利技术再一方面提供一种非洲猪瘟病毒的RAA检测方法，其包括：使用上述的用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针；或上述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂；或上述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂盒进行扩增检测。
[0012]本专利技术再一方面提供一种上述的用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针在检测非洲猪瘟病毒中的应用。
[0013]本专利技术有益效果包括：使用本专利技术提供的用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针对非洲猪瘟病毒进行检测，可以在10min
‑
20min内完成对ASFV的扩增，在15min
‑
25min内(扩增+显色)完成对ASF的检测，且不需要特殊仪器设备；敏感性为48.75拷贝/反应，与猪场常见病毒无交叉反应，与ASFV qPCR试剂盒的检测结果符合率可以达到100％，可用于ASF的现场快速检测。
附图说明
[0014]图1为引物
‑
探针组合的筛选，其中，1
‑
3分别为引物探针组合RAA
‑
F1/
‑
R1/
‑
P1、RAA
‑
F2/
‑
R2/
‑
P2和RAA
‑
F3/
‑
R3/
‑
P3；
[0015]图2为引物与探针浓度及反应条件的优化，其中，A：引物与探针的优化，1
‑
4分别为上、下游引物(2μmoL/L)及探针(2μmoL/L)的体积0.5μL、0.5μL和0.15μL，0.75μL、0.75μL和0.225μL，1.0μL、1.0μL和0.3μL，1.5μL、1.5μL和0.45μL；B：反应温度的优化，1
‑
5分别为反应温度37℃、38℃、39℃、40℃和41℃；C：反应时间的优化，1
‑
6分别为反应时间分别为5min、10min、15min、20min、25min、30min；
[0016]图3为可视化RAA方法的特异性检测，其中，P：阳性对照；N：阴性对照；1
‑
4分别为PEDV、CSFV、PRRSV和PRV的核酸；
[0017]图4为可视化RAA方法的敏感性测定，其中，1
‑
7分别为模板的浓度1.95
×
106、
×
105、
×
104、
×
103、
×
102、
×
101和
×
100个拷贝/μL；
[0018]图5为可视化RAA方法对临床样品的检测结果，1：阳性对照；2：阴性对照；3
‑
2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针，其特征在于，RAA引物对包括如SEQIDNO.1所示序列的上游引物和如SEQ ID NO.2所示序列的下游引物，探针包括如SEQIDNO.3所示序列。2.一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针。3.根据权利要求2所述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂，下游引物的5
′
端用BIO修饰；探针的5
′
端标记用DIG修饰，3
′
端用C3 Spacer修饰，探针中间的第31个碱基用THF取代。4.一种用于非洲猪瘟病毒检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的用于非洲猪瘟病毒检测的RAA引物对、探针，或权利要求2或3所述的用于非洲猪瘟病毒检测的试剂。5.一种非洲猪瘟病毒的RAA检测方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋勤叶，岳怀宁，袁晨，冯亚文，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：