【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及真菌检测，特别涉及高效、广谱检测真菌的引物探针组合、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、医药生物技术产业正迎来蓬勃发展期，重组蛋白、干细胞类制品、基因治疗药物等生物制品的种类也趋向于多元化。由于生物材料的原材料来源广，生产流程繁琐、成品基质复杂、具有生物活性等特点，容易受到真菌等微生物的污染。
2、真菌种类庞大而多样，全世界约有150万种真菌，某些真菌在发酵工业、食品加工业、抗生素生产中具有重要作用，少数真菌为人类和动物的致病菌，其中念珠菌属、曲霉属、青霉属、链格孢属、毛孢子菌属是常见人类致病真菌。2020年版《中国药典》三部中的“无菌检查”，规定了白色念珠菌和黑曲霉为必检真菌，“生物制品生产及检定用实验动物质量控制的要求”将皮肤病原真菌(表皮癣菌属、小孢子菌属和毛癣菌属)列为唯一待检真菌。然而，《中国药典》提供的传统真菌检测方法存在操作繁琐、检测周期长等局限性，完成一次检测至少需要14天，不适用于有效期短的产品(例如减毒活疫苗、细胞治疗产品)签发，也无法对生产过程及产品进行早期风险把控，不利于企业及时采取对应措施，故针对这类产量小、效期短、终产品需要快速放行的新型生物制品。因此，建立一种高效、快速，可替代传统方法的真菌检测方法势在必行。
3、真菌具有真正的细胞核和细胞器，属于真核生物，其核糖体为80s，有大小两个亚基组成；其中，40s的小亚基含18s rrna和20多种蛋白质，60s大亚基则含有28s、5.8s、和5s三种rrna以及50多种蛋白质。真菌的18s rdna的片段较长，片段中存在
4、dna提取过程中可能出现真菌dna污染的情况，在使用通用型检测方法进行样本检测时，环境中存在的腐生型真菌，操作者携带的定植真菌，以及dna提取试剂(盒)中存在的真菌dna污染均可能导致假阳性结果，影响样本的检测和判定。此外，大多数dna试剂(盒)无法提供具体的成分组成和来源，信息的缺失让选择变得困难，也增加了去除真菌dna污染的难度。
5、现有的真菌检测技术中，例如中国专利申请cn110616253a公开了一种基于微滴式数字pcr技术的检测真菌的试剂盒及方法，该试剂盒公开了一组用于微滴式数字pcr检测真菌的引物探针组合，引物探针组合是针对真菌高度保守的18s rrna基因序列进行筛选获得的。该专利申请还公开了相应的试剂盒，其对热带念珠菌基因组dna的检出限达到3.8拷贝/μl。然而，基于现有技术中鲜有针对多种致病真菌样本处理和检测的试剂盒，文献中也缺乏相关报道。
技术实现思路
1、基于市场上鲜少有针对多种致病真菌样本处理和检测的试剂盒，文献中也缺乏相关报道，本专利技术提供了高效、广谱检测真菌的引物探针组合、试剂盒及其应用，通过选择真菌(例如念珠菌属、曲霉属、青霉菌、毛癣菌属、小孢癣菌属、表皮癣菌属、链格孢属、枝孢菌属等多种致病真菌)小核糖体rna基因18s基因保守区作为扩增子，在多重序列比对的基础上设计一对真菌引物探针对，可特异性的覆盖超过多种真菌，包括常见致病性真菌，如白色念珠菌、曲霉菌属(黑曲霉、巴西曲霉、烟曲霉、黄曲霉、寄生曲霉等)、青霉菌属(例如产黄青霉等)、酵母菌属(例如克鲁斯假丝酵母、热带假丝酵母、季也蒙假丝酵母等)、链格孢菌属、枝孢菌属、石膏样毛廯菌等，同时扩增子中包含真菌18s基因可变区，可结合测序技术实现对常见病原性真菌属的快速鉴定，如念珠菌属、曲霉属、青霉菌、毛癣菌属、小孢癣菌属、表皮癣菌属、链格孢属、枝孢菌属；并建立了一种灵敏度高、含内控的多种病原真菌qpcr检测方法，同时此引物探针组也充分避免了与人及其他哺乳类动物的交叉反应，使结果更真实可靠。具体通过以下技术实现。
2、高效、广谱检测真菌的引物探针组合，包括正向引物、反向引物和检测探针，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述检测探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述检测探针的5’端偶联有第一荧光基团，3’端偶联有淬灭基团。
3、正向引物(f)的核苷酸序列为：5’-tcagttatcgtttatttga-3’；
4、反向引物(r)的核苷酸序列为：5’-cgaaagttgatagggcagaa-3’；
5、检测探针的核苷酸序列为：5’-ttgaatgaaccatcgcc-3’
6、优选地，上述引物探针组合中，所述第一荧光基团为fam、tet、ned、rox、cy3、cy5、vic、joe、hex、texas red或lc red460荧光基团，所述淬灭基团为mgb、tamra、nfq、eclipse、dabcyl、bhq1或bhq2淬灭基团。
7、优选地，上述引物探针组合中，所述第一荧光基团为fam荧光基团，所述淬灭基团为mgb淬灭基团。
8、本专利技术还要求限定所述的引物探针组合在制备用于高效、广谱检测真菌的产品中的应用。
9、本专利技术还提供了用于高效、广谱检测真菌的试剂盒，包括上述的引物探针组合，还包括内控探针和内控质粒；所述内控探针的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述内控探针的5’端偶联有第二荧光基团，3’端偶联有淬灭基团；所述第二荧光基团与所述第一荧光基团不同；所述内控质粒的核苷酸序列如seq id no.5所示。内控探针的淬灭基团可以与检测探针的相同或不同。
10、作为一种优选方式，内控探针具体为：5’-hex-atcctcccaagacgcat-mgb-3’；
11、内控质粒的核苷酸序列为：
12、atgcatgtctaagtataagcaatttatacagtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatcgtttatttgatagtaccttactacttggataaccgtggtaattctagagctaatacatgcttaaaatcccgactgtttggaagggatgtatttattagataaaaaatcaatgccttcgggctctttgatgattcataataacttttcgaatcgcatggccttgtgctatgcgtcttgggaggatatttctgccctatcaactttcgatggtaggatagtggcctaccatggtttcaacgggtaacggggaataagggttcgattccggagagggagcctgagaaac。
13、在采用qpcr进行核酸检测时，实验人员操作误差，标本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.高效、广谱检测真菌的引物探针组合，包括正向引物、反向引物和检测探针，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述检测探针的5’端偶联有第一荧光基团，3’端偶联有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的高效、广谱检测真菌的引物探针组合，其特征在于，所述第一荧光基团为FAM、TET、NED、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE、HEX、Texas RED或LC RED460荧光基团，所述淬灭基团为MGB、TAMRA、NFQ、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1或BHQ2淬灭基团。
3.权利要求1或2任一项所述的引物探针组合在制备用于高效、广谱检测真菌的产品中的应用。
4.用于高效、广谱检测真菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2任一项所述的引物探针组合，还包括内控探针和内控质粒。
5.根据权利要求4所述的用于高效、广谱检测真菌的试剂盒，其特征在于，所述内控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示
6.根据权利要求4所述的用于高效、广谱检测真菌的试剂盒，其特征在于，还包括qPCR反应液、无模板对照、阳性对照；所述qPCR反应液包括PCR缓冲液、dNTPs、热启动Taq聚合酶。
7.根据权利要求4所述的用于高效、广谱检测真菌的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取体系，所述核酸提取体系包括预裂解液、DNA酶、溶壁酶、核酸裂解液和proteinase K。
8.一种不以疾病诊断和治疗为目的的高效、广谱检测真菌的方法，其特征在于，采用权利要求4-7任一项所述的试剂盒；用于定性或定量检测细胞培养上清、细胞种子库、干细胞制品和生物制品中的真菌污染。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括提取供试品中核酸的步骤，具体为：
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.高效、广谱检测真菌的引物探针组合，包括正向引物、反向引物和检测探针，其特征在于，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如seqid no.2所示，所述检测探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述检测探针的5’端偶联有第一荧光基团，3’端偶联有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的高效、广谱检测真菌的引物探针组合，其特征在于，所述第一荧光基团为fam、tet、ned、rox、cy3、cy5、vic、joe、hex、texas red或lc red460荧光基团，所述淬灭基团为mgb、tamra、nfq、eclipse、dabcyl、bhq1或bhq2淬灭基团。
3.权利要求1或2任一项所述的引物探针组合在制备用于高效、广谱检测真菌的产品中的应用。
4.用于高效、广谱检测真菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2任一项所述的引物探针组合，还包括内控探针和内控质粒。
5.根据权利要求4所述的用于高效、广谱检测真菌的试剂盒，其特征在于，所述内控...
【专利技术属性】
技术研发人员：张若璇，罗祥，陈连栋，郝瑶，刘愈杰，柯贞进，幸晓莹，徐国东，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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