基于CRISPR-Cas系统的用于检测多种支原体的引物、crRNA及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR
‑
Cas系统的用于检测多种支原体的引物、crRNA及其应用


[0001]本专利技术涉及支原体核酸检测
，特别涉及基于CRISPR
‑
Cas系统的用于检测多种支原体的引物对、crRNA及其应用。

技术介绍

[0002]支原体是一类缺乏细胞壁，形态上呈高度多形性，能通过除菌滤器，能在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。支原体能引起各种动植物疾病；例如，肺炎支原体是呼吸道感染和肺炎的主要原因，溶脲脲原体和人型支原体能引起泌尿生殖道感染，螺原体能感染昆虫。支原体污染也是细胞培养的巨大威胁，容易使细胞代谢受阻，表面结构损伤，融合力降低等，进而对宿主的治疗性蛋白产生影响。据德国DSMZ细胞库研究学者调查数据显示，约有1/4的细胞受到支原体污染的影响。在生物制药行业中，支原体污染的影响几乎是毁灭性的。
[0003]考虑到生物制品的安全性、纯度和生产效力，支原体污染检测是生物制品质量控制过程中重要一环。各国监管部门也建立了相应的监管机制，中国药典通则3301对生物制品各生产环节做出了明确的规定。欧盟药典2.6.2指出，主细胞库、工作细胞库及病毒种子批和对照细胞使用培养法和细胞指示法对支原体进行检测；一些病毒的收获液和疫苗产品要进行培养法检测支原体污染。美国药典通则63指出，支原体污染检测是确保生物制品及其生产所用材料可靠性的一项必要的质量控制要求，日本药典的G3部分指出，生物制品用细胞基质要进行支原体检测。
[0004]目前监测支原体污染的主要方法是培养法和指示细胞法，这两类方法的监测周期长，工作量大。随着生物制品种类的不断增加，特别是以基因治疗、细胞治疗或者组织工程为基础的前沿治疗性药物的出现，细胞培养法和指示细胞检测方法的缺点更加明显。与生物大分子生物制品相比，大部分治疗性产品无法灭菌，有效期短且批产量较低，需要更加短的检测周期。因此，在很多国家的药典中都加入了快速放行的支原体污染检测方法。例如，欧盟药典和日本药典中指出核酸扩增技术(Nucleic acid amplification techniques，NAT)技术或者其他经过适当验证过的技术能够替代培养法和指示细胞法，并对NAT技术检测的灵敏度及特异性做了明确的规定：当拟替代培养法检测支原体时，NAT检测的灵敏度应达到10CFU/mL；当拟替代DNA染色法时，NAT检测的灵敏度应达到100CFU/mL。美国药典规定NAT技术能够代替培养法和指示细胞法用来对支原体进行检测。中国药典也指出除了采用培养法和指示细胞法对支原体进行检测之外，也可以采用经过国家药品检定机构认可的其他方法。
[0005]CRISPR
‑
Cas(Clustered ReguLarly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPRs)系统是细菌与病毒斗争中进化出的一套自我保卫的系统。目前，CRISPR
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Cas系统在体外诊断(IVD)中得到了广泛的利用，比较常见的有CRISPR
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Cas12、CRISPR
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Cas13和CRISPR
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Cas14等蛋白家族。CRISPR
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Cas12a蛋白是一种由crRNA引导的靶向DNA的核酸酶，其
能够结合并切割对应的DNA链。当CRISPR
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Cas12a蛋白与crRNA互补的含有PAM区域的靶向DNA结合时，其顺式的DNA酶活性被激活，对靶向DNA进行切割，同时还能够完全降解附近的线性或者环状单链DNA分子。

技术实现思路

[0006]本专利技术基于CRISPR
‑
Cas12a蛋白的功能特点，设计了一套能够用于高效靶向检测生物制品中的多种支原体23s rRNA基因的方法，包括用于制备crRNA的引物和相应的crRNA，以及利用crRNA检测生物制品中多种支原体污染的方法和检测试剂盒。基于PCR扩增和CRISPR
‑
Cas12a蛋白检测这两种技术的特异性和信号放大作用，本专利技术相当于对待检测目标进行了两次确认和两次信号放大，显著提高了检测的特异性，灵敏度和覆盖度。本专利技术提供的技术可以结合DNA Barcoding技术实现对污染支原体的鉴定；还可以运用侧向流检测技术，实现支原体可视化检测；操作简单，降低了仪器要求及成本，是一种高效的支原体鉴定及检测的方法。具体通过以下技术实现。
[0007]一种用于制备检测多种支原体的crRNA的引物，包括引物对F1、引物对F2、引物对F3和引物对F4；
[0008]所述引物对F1的正向引物序列(如SEQ ID NO.1所示)为：
[0009]5’‑
taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattatagtcagtacggctagg
‑3’
；
[0010]所述引物对F1的反向引物序列(如SEQ ID NO.2所示)为：
[0011]5’‑
cctagccgtactgactataatatctacacttagtagaaattaccctatagtgagtcgtatta
‑3’
；
[0012]所述引物对F2的正向引物序列(如SEQ ID NO.3所示)为：
[0013]5’‑
taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattgtattcagtacgcctagg
‑3’
；
[0014]所述引物对F2的反向引物序列(如SEQ ID NO.4所示)为：
[0015]5’‑
cctaggcgtactgaatacaatatctacacttagtagaaattaccctatagtgagtcgtatta
‑3’
；
[0016]所述引物对F3的正向引物序列(如SEQ ID NO.5所示)为：
[0017]5’‑
taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattgagatcagtaccccgagg
‑3’
；
[0018]所述引物对F3的反向引物序列(如SEQ ID NO.6所示)为：
[0019]5’‑
cctcggggtactgatctcaatatctacacttagtagaaattaccctatagtgagtcgtatta
‑3’
；
[0020]所述引物对F4的正向引物序列(如SEQ ID NO.7所示)为：
[0021]5’‑
taatacgactcactatagggtaatttctactaagtgtagatattgcattcagtacccctagg
‑3’
；
[0022]所述引物对F4的反向引物序列(如SEQ ID NO.8所示)为：
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于制备检测多种支原体的crRNA的引物，其特征在于，包括引物对F1、引物对F2、引物对F3和引物对F4；所述引物对F1的正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示；所述引物对F2的正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示；所述引物对F3的正向引物如SEQ ID NO.5所示，反向引物如SEQ ID NO.6所示；所述引物对F4的正向引物如SEQ ID NO.7所示，反向引物如SEQ ID NO.8所示。2.一种用于检测多种支原体的crRNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、采用权利要求1所述的引物，即采用所述引物对F1、F2、F3、F4合成所述crRNA的体外转录模板；S2、以步骤S1制备的所述体外转录模板为模板，进行体外转录，再回收产物，即所述crRNA。3.根据权利要求2所述的crRNA的制备方法，其特征在于，步骤S1中，转录反应体系为：无核酸水30μL、10μM所述引物对F1、F2、F3、F4的正向引物各5μL、10μM所述引物对F1、F2、F3、F4的反向引物各5μL、5
×
退火缓冲液10μL；转录反应程序是以0.1℃/s的速率由95℃开始降温至25℃。4.一种用于检测多种支原体的CRISPR
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Cas12a系统，其特征在于，包括采用权利要求2或3所述的制备方法制备的crRNA。5.根据权利要求4所述的CRISPR...

【专利技术属性】
技术研发人员：臧照星，徐国东，郝瑶，罗航，幸晓莹，刘愈杰，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：