茶树CsU6基因启动子及其克隆与应用制造技术

本发明专利技术公开了茶树CsU6基因启动子及其克隆与应用。本发明专利技术首次成功克隆了茶树内源CsU6基因启动子，并成功构建了茶树CsU6基因启动子转录活性检测载体，通过瞬时转化烟草叶片、GUS染色和GUS酶活测定，比较了八种CsU6启动子的转录活性，选择转录活性最强的CsU6i和CsU6j启动子用于茶树基因编辑载体构建，在茶树原生质体中验证了这两种启动子应用于茶树CRISPR/Cas9基因编辑系统的可行性，并实现了CRISPR/Cas9介导的茶树基因组靶向编辑。因此，茶树U6基因启动子克隆及启动子活性的表达分析，为研究与茶树及近缘植物的转化研究提供了高效的启动子序列，也可以实现对茶树高效精准的种质创新与品种遗传改良。创新与品种遗传改良。创新与品种遗传改良。

【技术实现步骤摘要】
茶树CsU6基因启动子及其克隆与应用


[0001]本专利技术属于生物技术和生物工程
，具体涉及茶树CsU6基因启动子及其克隆与应用。

技术介绍

[0002]茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)是一种多年生经济作物，茶树的新梢可以制成茶叶，为人体提供多种有益营养，包括黄酮、茶氨酸和生物碱等，被超过三分之二的世界人口饮用，茶叶已经成为世界上最受欢迎的健康、无酒精、消耗量仅次于水的饮料。茶树具有基因组大、杂合度高和物种多样性高等特点，广泛存在于茶树种内、种间的杂交不亲和性严重限制了茶树杂交育种中亲本的自由选配及优异基因在育种中的利用，成为限制茶树育种发展的瓶颈。目前茶树新材料的创制和新品种的选育主要是通过常规杂交、辐射诱变等育种方法，这些育种方法具有选育时间长、效率低、程序复杂等特征，因此迫切需要高效的技术手段来对茶树进行遗传改良。
[0003]基因编辑主要是利用序列特异核酸酶在特定基因位点产生DNA双链断裂，从而激活细胞自身修复机制——非同源末端连接或同源重组来实现基因的敲除、定点插入、替换和染色体重组等，最终实现基因组序列的改变。基因编辑技术已经在动物、植物和其它生物中得到了成功的应用，并在主要粮食及经济作物的精准育种方面发挥了重要的作用，在提高作物产量、品质和抗性等方面具有良好的应用前景。现有的基因编辑系统主要包括锌指核酸酶系统、类转录激活因子效应物核酸酶系统和CRISPR/Cas系统等。其中CRISPR/Cas系统由于载体构建过程简单、编辑效率高等优点，成为当前广泛应用的基因编辑系统。目前主要使用的CRISPR/Cas基因编辑体系主要包括CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系统等。CRISPR/Cas9系统由gRNA(guide RNA)和Cas9核酸内切酶构成，gRNA通过和靶序列的碱基配对结合到目标DNA上，同时招募Cas9蛋白，Cas9蛋白与gRNA结合并识别靶序列下游的PAM(protospacer adjacent motifs)位点，在PAM上游约3bp处切割DNA双链，形成DNA双链断裂，继而引发生物体内源性的DNA双链断裂修复。在DNA双链修复过程中会在双链断裂的位置引起若干碱基的插入或者缺失从而造成DNA靶位点的基因编辑。
[0004]在基因编辑系统中，gRNA的表达由RNA聚合酶III型启动子U3或U6驱动，目前在许多物种中已经克隆出了U3、U6启动子，但是对茶树中的CsU3、CsU6启动子的研究仍然缺乏。虽然U3、U6启动子已在多个物种的基因编辑中成功运用，但同一启动子在同源关系较远的物种间并不一定适用，且同一物种基因中常存在多个U3或U6启动子，其活性及转录效率存在一定差异。因此克隆茶树内源CsU3、CsU6启动子，并筛选出转录活性高的CsU3、CsU6启动子，有利于CRISPR/Cas基因编辑系统的完善以及该技术在茶树遗传育种中的应用，对于茶树的育种技术发展具有重要的作用。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于涉及提供一种茶树CsU6基因启动子
及其克隆与应用的技术方案。
[0006]为了实现以上目的，本申请具体采用以下技术方案：
[0007]本专利技术第一方面提供了茶树CsU6基因启动子，其包括启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j，所述CsU6a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CsU6b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，CsU6c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，CsU6e的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，CsU6g的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CsU6h的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CsU6i的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，CsU6j的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0008]本专利技术第二方面提供了一种克隆上述茶树CsU6基因启动子的方法，其包含以下步骤：
[0009](1)以茶树品种
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龙井43
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叶片基因组DNA为模板，针对每个CsU6基因启动子设计特异引物；
[0010](2)使用高保真酶2
×
Phanta Max Master Mix在50μL体系中进行PCR反应，PCR扩增的反应体系为：1μL模板DNA50
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400ng，2μL上游引物10μM，2μL下游引物10μM，25μL 2
×
Phanta Max Master Mix，20μL ddH2O；
[0011]PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，70℃终延伸5min；
[0012](3)将扩增产物通过BP反应克隆到pDONR221载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆测序，即分别获取包含茶树CsU6基因启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j序列的pDONR221载体。
[0013]进一步，针对启动子CsU6a的引物为CsU6a
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attB1和CsU6a
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attB2，所述CsU6a
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attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，CsU6a
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attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；针对启动子CsU6b的引物为CsU6b
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attB1和CsU6b
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attB2，所述CsU6b
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attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，CsU6b
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attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；针对启动子CsU6c的引物为CsU6c
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attB1和CsU6c
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attB2，所述CsU6c
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attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，CsU6c
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attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；针对启动子CsU6e的引物为CsU6e
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attB1和CsU6e
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attB2，所述CsU6e
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attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，CsU6e
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attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；针对启动子CsU6g的引物为CsU6g
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attB1和CsU6g
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attB2，所述CsU6g
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attB1的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示，CsU6g
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attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；针对启动子CsU6h的引物为CsU6h
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attB1和CsU6h
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at本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.茶树CsU6基因启动子，其特征在于包括启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j，所述CsU6a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，CsU6b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，CsU6c的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，CsU6e的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，CsU6g的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，CsU6h的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CsU6i的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，CsU6j的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。2.一种克隆权利要求1所述茶树CsU6基因启动子的方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)以茶树品种
‘
龙井43
’
叶片基因组DNA为模板，针对每个CsU6基因启动子设计特异引物；(2)使用高保真酶2
×
Phanta Max Master Mix在50μL体系中进行PCR反应，PCR扩增的反应体系为：1μL模板DNA50
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400ng，2μL上游引物10μM，2μL下游引物10μM，25μL 2
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Phanta Max Master Mix，20μL ddH2O；PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，53℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，70℃终延伸5min；(3)将扩增产物通过BP反应克隆到pDONR221载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆测序，即分别获取包含茶树CsU6基因启动子CsU6a、CsU6b、CsU6c、CsU6e、CsU6g、CsU6h、CsU6i和CsU6j序列的pDONR221载体。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，针对启动子CsU6a的引物为CsU6a
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attB1和CsU6a
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attB2，所述CsU6a
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attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，CsU6a
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attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；针对启动子CsU6b的引物为CsU6b
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attB1和CsU6b
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attB2，所述CsU6b
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attB1的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，CsU6b
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attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；针对启动子CsU6c的引物为CsU6c
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attB1和CsU6c
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attB2，所述CsU6c
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attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，CsU6c
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attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；针对启动子CsU6e的引物为CsU6e
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attB1和CsU6e
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attB2，所述CsU6e
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attB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，CsU6e
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attB2的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；针对启动子CsU6g的引物为CsU6g
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attB1和CsU6g
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attB2，所述CsU6g
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄建燕，傅前媛，雷蕾，郝心愿，王新超，杨亚军，
申请(专利权)人：中国农业科学院茶叶研究所，
类型：发明
国别省市：