LncRNAIFA吸附miR-26a在猪卵巢颗粒细胞中的应用制造技术

本发明专利技术公开了lncRNA IFA调控miR

【技术实现步骤摘要】
mimic是针对miR
‑
26a成熟miRNA设计并合成的小片段单链RNA，所述小片段单链RNA的序列与相应的miRNA序列相同。所述过表达miR
‑
26a时采用的miR
‑
26a mimic的序列为：5
’‑
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU
‑3’
(SEQ ID NO.4)。
[0012]进一步地，miR
‑
26a的表达水平降低通过miR
‑
26a核酸抑制物实现，采用的miR
‑
26ainhibitor是针对miR
‑
26a成熟miRNA设计并合成的小片段单链RNA，所述小片段单链RNA的序列与相应的miRNA序列反向互补。所述干扰miR
‑
26a时采用的miR
‑
26a inhibitor的序列为：5
’‑
AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA
ꢀ‑3’
(SEQ ID NO.5)。
[0013]LncRNA IFA竞争性吸附miR
‑
26a在猪卵巢颗粒细胞中的应用，体外环境的猪卵巢颗粒细胞中，由增加外源性lncRNA IFA引起的促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进细胞活性、促进细胞周期进程中的任意一种或多种功能表型，能在增加外源性miR
‑
26a后逆转。
[0014]进一步地，增加外源性lncRNA IFA通过基因过表达技术实现，采用的基因过表达载体通过如下方式制备得到：
[0015](1)提取猪卵巢颗粒细胞的RNA，将其逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到目的片段；
[0016](2)将目的片段连接到用限制性内切酶BamH I和Xba I酶切后的pcDNA3.1载体上，得到重组载体。
[0017]步骤(1)中进行PCR扩增所用引物如下所示：
[0018]lncRNA IFA F：5
’‑
GGCGATGCCTGGGTACATGG
‑3’
；
[0019]lncRNA IFA R：5
’‑
GAGACCGCGTCCACTCCGCC
‑3’
。
[0020]本专利技术所述lncRNA IFA(Inhibitor of Follicular Atresia，暂命名)为针对猪卵巢颗粒细胞进行RNA
‑
seq所获得的lncRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0021]本专利技术前期通过基因工程和细胞工程技术，发现lncRNA IFA可以促进卵巢颗粒细胞的增殖、抑制凋亡，同时增强卵巢颗粒细胞的细胞活性，加快卵巢颗粒细胞的细胞周期进程。具体为通过EdU(5
‑
Ethynyl
‑
2'
‑
deoxyuridine)实验证明，在体外环境下，过表达lncRNA IFA可以促进卵巢颗粒细胞的增殖(P<0.01)，而干扰lncRNA IFA则抑制卵巢颗粒细胞的增殖(P<0.05)；通过CCK8(Cell Counting Kit
‑
8)实验证明，在体外环境下，过表达lncRNA IFA后卵巢颗粒细胞的细胞活性显著增强(P<0.01)，而干扰lncRNA IFA后卵巢颗粒细胞的细胞活性被显著抑制(P<0.01)；通过流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)实验证明，在体外环境下，过表达lncRNA IFA可显著抑制卵巢颗粒细胞的凋亡(P<0.01)，并加快卵巢颗粒细胞的细胞周期进程(P<0.05)，干扰lncRNA IFA后，卵巢颗粒细胞凋亡率显著下降(P<0.001)，且细胞周期进程被显著抑制(P<0.01)。
[0022]本专利技术前期通过生物信息学手段，确定了lncRNA IFA序列中存在的miR
‑
26a结合位点。
[0023]本专利技术的验证结果如下：
[0024]1、本专利技术通过生物信息学手段预测到lncRNA IFA序列中存在的miR
‑
26a结合序列，预测结果显示lncRNA IFA序列中存在一个miR
‑
26a的结合位点(图1中a)。
[0025]2、本专利技术通过Pull down实验检测到，lncRNA IFA与miR
‑
26a存在直接结合(图1中b)。
[0026]3、本专利技术通过双荧光素酶实验检测到，与转染PGLO
‑
IFA
‑
WT+mimic NC组的细胞相
比，PGLO
‑
IFA
‑
WT+miR
‑
26a mimic组的细胞相对荧光活性显著下降；而PGLO
‑
IFA
‑
MUT+mimic NC组与PGLO
‑
IFA
‑
MUT+miR
‑
26a mimic组细胞的相对荧光活性无显著差异(图1中c)。
[0027]4、本专利技术通过qPCR检测到，在过表达miR
‑
26a后，lncRNA IFA的表达量显著下降，而干扰miR
‑
26a后，lncRNA IFA的表达量显著上升(图2)。
[0028]5、本专利技术通过CCK8(Cell Counting Kit
‑
8)实验证明，在体外环境下，过表达lncRNA IFA后卵巢颗粒细胞的细胞活性显著增强；而同时过表达lncRNA IFA与miR
‑
26a后卵巢颗粒细胞的细胞活性又出现了显著下降(图4中c)。
[0029]6、本专利技术通过流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)实验证明，在体外环境下，过表达lncRNA IFA可显著抑制卵巢颗粒细胞的凋亡，并加快卵巢颗粒细胞的细胞周期进程；而同时过表达lncRNA IFA与miR
‑
26a后卵巢颗粒细胞的凋亡比例出现回升，细胞周期进程被再次阻滞(图3)。
[0030]7、本专利技术通过EdU(5
‑
Ethynyl
‑
2'
‑
deoxyuridine)实验证明，在体外环境下，过表达lncRNA IFA后卵巢颗粒细胞的增殖率显著升高；而同时过表达lncRNA IFA与miR
‑
26a后卵巢颗粒细胞的增殖率又出现了显著下降(图4中b)。
[0031]本专利技术以lncRNA IFA与miR
‑
26a为研究对象，采用分子细胞生物学的方法，首先验证了lncRNA IFA与miR
‑
26a的直接结合；随后检测了miR
‑
26本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控猪卵巢颗粒细胞lncRNA IFA表达的方法，其特征在于：体外环境下，miR
‑
26a通过靶向lncRNA IFA的RNA分子从而负调控猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFA的表达；通过调节miR
‑
26a的表达水平，可实现猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFA表达的调控；所述的lncRNA IFA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的调控猪卵巢颗粒细胞lncRNA IFA表达的方法，其特征在于：miR
‑
26a与lncRNA IFA的RNA分子结合并调控其表达水平，miR
‑
26a的表达水平升高，lncRNA IFA表达量上升，miR
‑
26a的表达水平降低，lncRNA IFA表达量下降。3.根据权利要求2所述的调控猪卵巢颗粒细胞lncRNA IFA表达的方法，其特征在于：miR
‑
26a的表达水平升高通过miR
‑
26a模拟物实现，采用的miR
‑
26a mimic的序列为：5
’‑
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU
‑3’
。4.根据权利要求2所述的调控猪卵巢颗粒细胞lncRNA IFA表达的方法，其特征在于：miR
‑
26a的表达水平降低通过miR
‑
26a核酸抑制物实现，采用的miR
‑
26a inhibitor的序列为：5
’‑
AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA
‑3’
。5.LncRNA IF...

【专利技术属性】
技术研发人员：李加琪，张哲，李念，胡梦婷，李硕，郭懿萱，张豪，陈赞谋，袁晓龙，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：