基于CRISPR-dCas9的基因靶向去甲基化方法及其应用技术

本发明专利技术提供用于基因靶向去甲基化的系统及其应用。本发明专利技术通过设计sgRNA以及可表达定位功能元件与去甲基化功能元件的载体，以慢病毒感染细胞的方式，配合药物筛选，在sgRNA引导下定位功能元件识别靶基因组DNA，再利用去甲基化功能元件对靶基因组DNA进行去甲基化，提供一种精确的表观遗传编辑技术，逆转由于启动子高甲基化修饰导致的基因表达沉默，恢复基因的正常功能，调控表观遗传修饰的方式，为因表观遗传修饰失常引起疾病的治疗提供更多可选选项。选项。选项。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR
‑
dCas9的基因靶向去甲基化方法及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及一种用于基因靶向去甲基化的系统及其应用。

技术介绍

[0002]DNA甲基化在食管鳞癌的发生发展中发挥着重要作用，有许多异常甲基化基因被报道为食管鳞癌患者的诊断和预后标志物。由于DNA甲基化是可逆的，因此DNA甲基化在食管鳞癌的治疗中具有巨大的潜力。临床医生针对DNA甲基化异常的癌症患者主要使用DNA甲基转移酶抑制剂(DNA methyltransferase inhibitors,DNMTis)进行治疗。常用的临床药物包括阿扎胞苷和地西他滨，它们可以通过抑制DNA甲基化从而逆转抑癌基因的表达沉默，进而呈现出较好的肿瘤抑制效果，在血液癌症的治疗有一定的效果，但常见获得性耐药，且在实体瘤的治疗中效果并不理想。此类药物仅靶向作用于抑制DNA甲基化转移酶，缺乏基因靶向性，不能靶向于特定的基因，可能会扰乱其它基因原本正常的甲基化状态及转录水平，因此此类药物的疗效和安全性有待进一步考究。
[0003]CRISPR
‑
Cas9是一种通用高效的针对基因组特定位点进行精确编辑的技术。核酸内切酶Cas9蛋白在细胞内sgRNA的引导下能够通过碱基互补配对原则识别靶标的基因组DNA，并由Cas9蛋白的活性结构域对NGG序列上游3
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4碱基之间的DNA进行剪切，产生双链DNA损伤(double
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strand break,DSB)。断裂的DNA可以通过非同源末端连接(non
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homologous end joining)或者同源重组(homologous recombination)被修复，从而达到基因靶向敲除的目的。LentiCRISPR质粒是Broad Institute中心的张峰基于CRISPR
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Cas9技术推出了一种可用于慢病毒包装的质粒，该质粒的优点为：一、可以通过慢病毒感染细胞的方式实现靶向基因的稳定性敲除；二、病毒感染成功的细胞可以通过药物进行筛选，方便易操作。dCas9(nuclease“dead”Cas9)蛋白是Cas9蛋白的突变体，即Cas9内切酶的RuvC1和HNH两个核酸酶活性区域同时发生突变，使其丧失DNA剪切作用，因此，dCas9蛋白的内切酶活性全部消失，只保留由gRNA引导进入基因组的能力。Tet1CD是可以进行DNA去甲基化的最小功能单位。通过选用LentiCRISPR质粒，在CRISPR/Cas9的基础上进一步将Cas9蛋白去掉核酸酶活性，改造为dCas9，并将其与Tet1CD进行连接，形成融合蛋白dCas9
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Tet1CD，即可在细胞内sgRNA的引导下实现DNA的靶向去甲基化功能。
[0004]因此有必要提供一种精确的表观遗传编辑技术，逆转由于启动子高甲基化修饰导致的基因表达沉默，恢复基因的正常功能，调控表观遗传修饰的方式，为食管鳞癌的治疗提供更多可选选项。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术通过设计sgRNA以及可表达定位功能元件与去甲基化功能元件的载体，以慢病毒感染细胞的方式，配合药物筛选，在sgRNA引导下定位功能元件识别靶基因组DNA，再利用去甲基化功能元件对靶基因组DNA进行去甲基化，提供一种精确的表观遗
传编辑技术，逆转由于启动子高甲基化修饰导致的基因表达沉默，恢复基因的正常功能，调控表观遗传修饰的方式，为因表观遗传修饰失常引起疾病的治疗提供更多可选选项。
[0006]本专利技术第一方面提供用于基因靶向去甲基化的sgRNA，包括sgZNF154
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1、sgZNF154
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2和/或sgZNF154
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3；其中sgZNF154
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1包括如SEQ ID NO:13所示的正向序列及如SEQ ID NO:14所示的反向序列，sgZNF154
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2包括如SEQ ID NO:15所示的正向序列及如SEQ ID NO:16所示的反向序列，sgZNF154
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3包括如SEQ ID NO:17所示的正向序列及如SEQ ID NO:18所示的反向序列。
[0007]本专利技术第二方面提供用于基因靶向去甲基化的复合物，主要由如本专利技术第一方面所述的sgRNA和融合蛋白相互结合形成，所述的融合蛋白包括定位功能元件和去甲基化功能元件。
[0008]在本专利技术一实施例中，所述定位功能元件具有靶向和结合DNA的功能但无催化活性，包括Cas蛋白、锌指蛋白或TALENs蛋白，或其功能域，或其组合。
[0009]在本专利技术一优选实施例中，所述定位功能元件包括dCas9、dCpf1、dCas12、dCas13、dCms1、dMAD7，或其功能域，或其组合。
[0010]在本专利技术一优选实施例中，所述定位功能元件包括dCas9或其功能域。
[0011]在本专利技术一实施例中，所述去甲基化功能元件具有具有将甲基化胞嘧啶转换为非甲基化胞嘧啶的功能，包括ROS1、TET、DME、DML，或其组合。
[0012]在本专利技术一优选实施例中，所述定位功能元件包括Tet1、Tet2、Tet3或其功能域，或其组合。
[0013]在本专利技术一优选实施例中，所述定位功能元件包括Tet1或其功能域。
[0014]在本专利技术一实施例中，所述定位功能元件和去甲基化功能元件通过一个或多个下列组件连接：肽键、连接肽、核定位信号、表位标签，或其组合。
[0015]本专利技术第三方面提供用于基因靶向去甲基化的载体，包括如本专利技术第一方面所述的sgRNA和编码如本专利技术第二方面所述融合蛋白的核酸序列。
[0016]在本专利技术一实施例中，所述编码融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:29所示。
[0017]本专利技术第四方面提供用于基因靶向去甲基化的宿主细胞，包括如本专利技术第一方面所述的sgRNA、如本专利技术第二方面所述的复合物和/或如本专利技术第三方面所述的载体。
[0018]本专利技术第五方面提供用于基因靶向的去甲基化方法，包括以下步骤：
[0019]1)靶向ZNF154启动子区域设计候选sgRNA；
[0020]2)将步骤1)所得sgRNA连接编码如本专利技术第二方面所述融合蛋白的核酸序列，构建靶向ZNF154启动子去甲基化的载体；
[0021]3)包装含步骤2)所得载体的宿主细胞；
[0022]4)将步骤3)所得宿主细胞加入食管癌细胞，药物筛选获取去甲基化成功的细胞；
[0023]5)筛选验证去甲基化效果好的载体或载体组合。
[0024]在本专利技术一实施例中，步骤2)编码所述融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:29所示。
[0025]在本专利技术一实施例中，步骤3)所述宿主细胞为293T细胞。
[0026]在本专利技术一实施例中，步骤4)所述食管癌细胞为Kyse30细胞。
[0027]在本专利技术一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于基因靶向去甲基化的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括sgZNF154
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1、sgZNF154
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2和/或sgZNF154
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3；其中sgZNF154
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1包括如SEQ ID NO:13所示的正向序列及如SEQ ID NO:14所示的反向序列，sgZNF154
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2包括如SEQ ID NO:15所示的正向序列及如SEQ ID NO:16所示的反向序列，sgZNF154
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3包括如SEQ ID NO:17所示的正向序列及如SEQ ID NO:18所示的反向序列。2.用于基因靶向去甲基化的复合物，其特征在于，所述复合物主要由如权利要求1所述的sgRNA和融合蛋白相互结合形成，所述的融合蛋白包括定位功能元件和去甲基化功能元件。3.如权利要求2所述的复合物，其特征在于，所述定位功能元件具有靶向和结合DNA的功能但无催化活性，包括Cas蛋白、锌指蛋白或TALENs蛋白，或其功能域，或其组合。4.如权利要求2所述的复合物，其特征在于，所述去甲基化功能元件具有将甲基化胞嘧啶转换为非甲基化胞嘧啶的功能，包括ROS1、TET、DME、DML，或其组合。5.用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵建永，何文婷，武远众，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：