快速检测野生型腺相关病毒的引物探针、试剂盒及方法和应用技术

本发明专利技术公开了快速检测野生型腺相关病毒的引物探针、试剂盒及方法和应用，涉及腺相关病毒检测技术领域。所述引物探针包括两组引物探针组合；第一组引物探针组合的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示；第二组引物探针组合的正向引物序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物序列如SEQ ID NO.5所示，探针序列如SEQ ID NO.6所示。本发明专利技术的引物探针组合能一次性、特异性地检测1

【技术实现步骤摘要】
快速检测野生型腺相关病毒的引物探针、试剂盒及方法和应用


[0001]本专利技术涉及腺相关病毒检测
，特别涉及野生型腺相关病毒的引物探针、试剂盒及方法和应用。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(Adeno
‑
associated virus，AAV)属于微小病毒科，依赖病毒属，于1965年作为腺病毒制剂中的污染物首次被发现。腺相关病毒是一种无包膜，具有二十面体结构的病毒，病毒颗粒直径为20
‑
25nm，包含一个约4.7kb的ssDNA基因组。AAV基因组的两末端为145bp的倒置末端重复序列(inverted terminal repeat，ITR)，ITR序列之间为AAV的编码区，含两个开放阅读框(open reading frames，ORF)。5
’
端的ORF编码包含4个重叠基因，这些基因编码AAV复制和整合所需的非结构蛋白(Rep)；3
’
端的ORF编码病毒的3种衣壳蛋白(Cap)，即VP1、VP2、VP3，决定着病毒的组织嗜性。ITR包含病毒复制、整合、拯救和包装所需的顺式作用元件，并具有转录启动子的活性。AAV为复制缺陷型病毒，只有在辅助病毒(腺病毒或疱疹病毒)共同感染条件下才会发生产毒性感染。在无辅助病毒存在时，AAV病毒基因组偏向于整合到人基因组19号染色体上建立潜伏感染。
[0003]迄今为止，已经分离出超过100种血清型的AAV，其中AAV1
‑
AAV13属于灵长类动物血清型。AAV2、3、5和6发现于人类细胞，而AAV1、4和7
‑
13来源于非人类的灵长类动物。除了AAV5是从人类尖锐湿疣中分离的，所有来源于灵长类动物的AAV最初都是作为腺病毒制剂的污染物被发现的。虽然目前没有直接证据表明AAV与人类疾病相关，但作为腺病毒生产的污染控制，FDA在《Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy》第一稿中对AAV残留的质量控制就有明确规定，建议对主细胞库、主病毒种子库和腺病毒最终产品进行AAV检测。
[0004]目前，国内外在质量控制中主要采用普通PCR对常见腺相关病毒的保守序列进行扩增来进行质量控制。普通PCR需要通过凝胶电泳进行鉴定，操作繁琐，灵敏度偏低，不方便进行准确定量。中国专利申请CN114075610A公开的检测野生型腺相关病毒的通用引物，初次使用了SYBR green I qPCR法对AAV进行检测，其灵敏度可达100copies/reaction，但未加质粒标准品组在35ct时也会起峰。TaqMan实时荧光定量PCR技术具有快速、特异、灵敏以及能准确定量等特点，在病毒核酸检测中得到广泛应用。目前，尚未有可快速、高效、定量地检测13种血清型的野生型AAV(AAV1
‑
13)的TaqMan实时荧光定量方法。

技术实现思路

[0005]为了解决普通PCR在检测腺相关病毒时操作繁琐，灵敏度低，不方便进行准确定量的不足，实现快速、高效、定量地检测13种血清型的野生型AAV1
‑
13，本专利技术提供了野生型腺相关病毒的引物探针、试剂盒及方法和应用，采用TaqMan双重实时荧光定量技术，针对AAV1
‑
AAV13的Rep保守序列设计了两组引物探针，既可快速准确高效检测来源于灵长类动
物的所有腺相关病毒，又可将序列差异较大的AAV5与其他血清型进行区分。为实现上述目的，本专利技术具体通过以下技术实现。
[0006]本专利技术提供的快速检测野生型腺相关病毒的引物探针组合，包括两组引物探针组合；第一组所述引物探针组合的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；第二组所述引物探针组合的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0007]两组所述引物探针组合的探针的5
’
端均偶联有不同的荧光标记，3
’
端均偶联有淬灭基团。上述两组引物探针组合的探针序列中，兼并碱基V代表C、G或A，兼并碱基Y代表C、T，兼并碱基S代表G、C，兼并碱基R代表A、G。
[0008]优选地，所述荧光标记为FAM、TET、NED、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE或HEX荧光标记；所述淬灭基团为TAMRA、NFQ、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1或BHQ2淬灭基团。
[0009]更优选地，第一组所述引物探针组合的探针5
’
端偶联FAM荧光标记，3
’
端偶联的淬灭基团为BHQ1；第二组所述引物探针组合的探针5
’
端偶联HEX荧光标记，3
’
端偶联的淬灭基团为BHQ1。
[0010]本专利技术还提供了上述的引物探针组合在制备用于快速检测野生型腺相关病毒的产品中的应用。
[0011]本专利技术还提供了一种用于快速检测野生型腺相关病毒的试剂盒，包括上述的引物探针组合。
[0012]优选地，上述试剂盒中还包括PCR反应液、阳性对照灭活病毒、阴性对照、第一阳性标准质粒、第二阳性标准质粒、PCR级别水；所述第一阳性标准质粒和第二阳性标准质粒分别含有AAV2和AAV5的Rep基因的前1440bp片段。
[0013]本专利技术提供的上述定量试剂均保存于
‑
20℃，并尽量减少反复冻融。
[0014]更优选地，所述PCR反应液为Taq Pro HS Universal U+Probe Master Mix，其中含有PCR缓冲液、dNTPs、热启动Taq聚合酶和MgCl2；所述阳性对照灭活病毒是通过腺病毒辅助扩增并且已灭活的AAV2病毒。
[0015]本专利技术还提供了一种不以疾病诊断和治疗为目的的快速检测野生型腺相关病毒的方法，采用上述任意一项的试剂盒，用于定性/定量检测腺病毒基因治疗产品中的AAV污染，或用于定性/定量检测其他生物制品、培养细胞、人体组织或血液样本中的AAV污染。
[0016]优选地，上述检测方法包括以下步骤：
[0017]S1、提取待测样品DNA，用PCR级别水对待测样品DNA洗脱若干次；将阳性对照灭活病毒稀释10000倍；阴性对照取无菌PBS溶液和待测样品同步操作；
[0018]将1
×
109copies/μl的第一阳性标准质粒和第二阳性标准质粒分别(用PCR级别水)先稀释至2
×
108copies/μl，再将两者等体积混合；然后依次按10倍梯度稀释至1
×
101copies/μl(即分别为1
×
107、1
×
106、1
×
105、1
×
104、1
×本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.快速检测野生型腺相关病毒的引物探针组合，其特征在于，包括两组引物探针组合；第一组所述引物探针组合的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；第二组所述引物探针组合的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；两组所述引物探针组合的探针5
’
端均偶联有不同的荧光标记，3
’
端均偶联有淬灭基团。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光标记为FAM、TET、NED、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE或HEX荧光标记；所述淬灭基团为TAMRA、NFQ、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1或BHQ2淬灭基团。3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，第一组所述引物探针组合的探针5
’
端偶联FAM荧光标记，3
’
端偶联的淬灭基团为BHQ1；第二组所述引物探针组合的探针5
’
端偶联HEX荧光标记，3
’
端偶联的淬灭基团为BHQ1。4.权利要求1
‑
3任一项所述的引物探针组合在制备用于快速检测野生型腺相关病毒的产品中的应用。5.一种用于快速检测野生型腺相关病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
‑
3任一项所述的引物探针组合。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液、阳性对照灭活病毒、阴性对照、第一阳性标准质粒、第二阳性标准质粒、PCR级别水；所述第一阳性标准质粒和第二阳性标准质粒分别含有AAV2和AAV5的Rep基因的前1440bp片段。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为Taq Pro HS Universal U+Probe Master Mix，其中含有PCR缓冲液、dNTPs、热启动Taq...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝瑶，许静，罗航，徐国东，王明珍，刘愈杰，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：