甘蔗病毒的多重RAA恒温检测方法及其试剂盒与应用技术

本发明专利技术公开了甘蔗病毒的多重RAA恒温检测引物组，包括甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的双重RAA检测引物对，还包括甘蔗线条花叶病毒的RAA检测引物对。发明专利技术人据此还研制了相应的多重RAA检测试剂盒并建立了相应检测方法。本发明专利技术可同时检测甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗线条花叶病毒，研究表明，本发明专利技术最低可检测到104copies/ul，特异度为100％，适合甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗线条花叶病毒单一及混合体系的快速检测。与现有技术相比，本发明专利技术具有多重检测、灵敏度高、特异性强、操作简单、检测快速、耗材少等特点，适合田间现场同时对多种病害进行检测调查。相应试剂盒检测快速、结果可靠、可以规模批量推广使用。可以规模批量推广使用。

【技术实现步骤摘要】
甘蔗病毒的多重RAA恒温检测方法及其试剂盒与应用


[0001]本专利技术属于甘蔗病毒检测领域，尤其涉及一种甘蔗病毒的多重RAA恒温检测方法及其试剂盒与应用。

技术介绍

[0002]甘蔗生长在高温高湿的热带和亚热带地区，作为我国重要的糖料作物和能源作物，具有很大的经济价值。但由于其生长周期长，又以无性繁殖方式为主，长期受各种病害侵扰。广西是我国最大的甘蔗种植地区，此类甘蔗病害一旦爆发将对广西甘蔗产业造成极大的危害。
[0003]甘蔗花叶病(Sugarcane Mosaic Disease,SMD)是危害较严重、范围广泛的甘蔗病害，导致这种病的病原病毒有3种，分别为：高粱花叶病毒(Sorghum mosaics virus,SrMV)、甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)和甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)。上述三种病毒是正义单链RNA病毒，其中SrMV与SCMV属于马铃薯Y病毒科马铃薯Y病毒属，SCSMV属于马铃薯Y病毒科禾本科病毒属。前两者可以通过蚜虫、机械摩擦、种质等非持久性传播方式进行传播，而SCSMV不能通过蚜虫传播。在广西和广东的主要蔗区，SCMV是造成甘蔗花叶病的优势种，其发病率由种苗带毒率决定，因此具有一定的隐匿性。病株表现为叶片平行于叶脉处会出现不同大小、长短的黄绿相间的褪绿斑纹，其中表现最明显的是叶基部，严重时斑纹布满叶片，甚至出现黄白斑或坏疽，造成植株生长缓慢。在气温较高的蔗区，患病植株症状表现的更明显。甘蔗花叶病可以造成甘蔗品种退化、产量下降。
[0004]目前检测病毒常用的方法可分为分子检测技术和血清学检测技术两类。其中，常见的分子检测技术有PCR检测、实时荧光定量PCR检测和环介导等温扩增(LAMP)检测，此类检测技术不仅对检测环境和设备要求高，而且检测周期较长，难以满足快速检测大量样品的需求。常见的血清学检测技术有ELISA检测、Dot
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ELISA检测和胶体金试纸条检测等，此类检测技术的假阳性较高，适用于大量样品的初步检测，不适于作为确诊性检测；经过初步检测筛选出的样品仍然需要采用分子检测技术进行验证确诊。并且甘蔗种植蔗区较大，采集样品回实验室检测极为不便。因此，建立一种检测快速、特异灵敏、设备要求低的SCYLV高效检测方法，对田间病害现场调查，防止该病毒传播，以及建立甘蔗健康种苗体系等具有重要意义。
[0005]重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)技术因具有等温扩增、设备要求低和检测速度快等优点，正在成为一种快速、特异、高效的鉴定病原微生物的检测技术。其工作原理是利用重组酶，单链结合蛋白和DNA聚合酶在等温的条件下扩增核酸。与PCR技术相比，RAA检测方法无需热变性、温度循环，适合在非实验室或者现场条件下进行大量样品的检测。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、抗干扰能力强、操作简
单、检测快速的甘蔗病毒的多重RAA恒温检测方法及其试剂盒与应用，该法能够同时检测甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗线条花叶病毒。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的双重RAA检测引物对，为特异性正向引物和反向引物，它们分别具有序列表中CP
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4F(SEQ.NO.ID 7)和CP
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4R(SEQ.NO.ID 8)的碱基序列。
[0009]甘蔗病毒的多重RAA恒温检测引物组，包括上述甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的双重RAA检测引物对，还包括甘蔗线条花叶病毒的RAA检测引物对；甘蔗线条花叶病毒的RAA检测引物对为特异性正向引物和反向引物，它们分别具有序列表中SCSMV
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1F(SEQ.NO.ID9)和SCSMV
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1R(SEQ.NO.ID 10)的碱基序列。
[0010]甘蔗病毒的多重RAA恒温检测试剂盒，含有上述检测引物组。
[0011]上述多重RAA恒温检测试剂盒，包括RAA反应酶系、阳性对照标准品。
[0012]RAA反应酶系包括1mM dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白、50ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、Exo核酸外切酶、100ng/μL肌酸激酶、100mM Tricine、甘蔗病毒的多重RAA恒温检测引物组。
[0013]甘蔗病毒的多重RAA恒温检测引物组中，甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的双重RAA检测引物对(CP
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4F/4R)与甘蔗线条花叶病毒的RAA检测引物对(SCSMV
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1F/1R)的体积比为1.3:1。
[0014]上述多重RAA恒温检测试剂盒，还包括Buffer A和Buffer B，Buffer A为20％ PEG，Buffer B为280mM醋酸镁。
[0015]上述多重RAA恒温检测引物组或多重RAA恒温检测试剂盒用于检测甘蔗中的甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗线条花叶病毒。
[0016]甘蔗病毒的多重RAA恒温检测方法，按以下步骤进行：
[0017]A.提取总RNA：将适量的待检甘蔗叶样品通过液氮处理研磨成粉末，再提取样品的总RNA；将提取的样品总RNA用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性；
[0018]B.反转录：以步骤A中提取的总RNA反转录获得cDNA模板；
[0019]C.配置RAA反应体系：在RAA反应酶系中加入45.5μL的20％PEG、2μL的cDNA模板、2.5μL醋酸镁，以DEPC水代替cDNA模板作为阴性对照，阳性对照标准品代替cDNA模板作为阳性对照，上下颠倒5
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6次混匀；
[0020]D.恒温扩增：将混匀的反应体系置于金属浴或水浴锅等温控装置中反应；
[0021]E.检测结果判定：将反应产物在200V电压下凝胶电泳10min，经凝胶成像系统拍照观察检测结果；以Maker为参照，在128bp位置有条带的为甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒中至少有一种为阳性；在315bp位置有条带的为甘蔗线条花叶病毒为阳性；没有条带的为阴性。
[0022]步骤D中金属浴或水浴锅温度为39℃，反应20min
[0023]针对现有甘蔗中的甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗线条花叶病毒无法快速、准确在田间混合检测的问题，专利技术人以甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的CP蛋白中的高度保守核酸序列为靶序列设计了甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的双重RAA恒温检测引物对，同时以甘蔗线条花叶病毒的基因组中高度保守序列为靶序列设计了甘蔗线条花叶病的RAA恒温检测引物对，据此组合构成甘蔗病毒的多重RAA恒温检测引物组，还研制了相应多重RAA
恒温检测试剂盒并建立了相应检测方法。该法原理是利用重组酶，单链结合蛋白和DNA聚合酶在等温的条件下扩增甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒和甘蔗线条花本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的双重RAA检测引物对，其特征在于为特异性正向引物和反向引物，它们分别具有序列表中CP
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4F和CP
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4R的碱基序列。2.甘蔗病毒的多重RAA恒温检测引物组，其特征在于包括权利要求1所述甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的双重RAA检测引物对，还包括甘蔗线条花叶病毒的RAA检测引物对；所述甘蔗线条花叶病毒的RAA检测引物对为特异性正向引物和反向引物，它们分别具有序列表中SCSMV
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1F和SCSMV
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1R的碱基序列。3.一种甘蔗病毒的多重RAA恒温检测试剂盒，其特征在于含有权利要求2所述检测引物组。4.根据权利要求3所述的多重RAA恒温检测试剂盒，其特征在于包括RAA反应酶系、阳性对照标准品。5.根据权利要求4所述的多重RAA恒温检测试剂盒，其特征在于所述RAA反应酶系包括1mM dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白、50ng/μL Rad51、30ng/μLBsu DNA聚合酶、Exo核酸外切酶、100ng/μL肌酸激酶、100mM Tricine、甘蔗病毒的多重RAA恒温检测引物组。6.根据权利要求5所述的多重RAA恒温检测试剂盒，其特征在于：所述甘蔗病毒的多重RAA恒温检测引物组中，甘蔗花叶病毒和高粱花叶病毒的双重RAA检测引物对与甘蔗线条花叶病毒的RAA检测引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书一页说明书九页序列表电子公布附图五页，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：