快速广谱检测支原体的引物探针组合、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种快速广谱检测支原体的引物探针组合、试剂盒及其应用，涉及支原体检测技术领域。引物探针组合包括10条正向引物，5条反向引物和4条检测探针；正向引物序列如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
快速广谱检测支原体的引物探针组合、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及支原体检测
，特别涉及快速广谱检测支原体的引物探针组合、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]“支原体”通常被用作柔膜菌纲中所有细菌的惯用名，是一类无细胞壁、形态多样可变，大小介于细菌和病毒之间(直径0.1
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0.3μm)的原核微生物。目前已从污水、植物、动物、禽类、昆虫、人、温泉或其他高温环境中发现200多种支原体。支原体的基因组大小为0.58
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2.2Mbp，碱基GC含量较低(23
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40mol％)，可自由生活进行二分裂繁殖，也可在细胞膜上共生或细胞内寄生，并具有宿主细胞特异性。支原体感染宿主细胞主要有三个方面的机理：细胞黏附、细胞侵入和细胞融合。细胞受到支原体感染后，可能无明显表型变化，也可能生长速度变慢，产生细胞病变效应，甚至发生染色体畸变和细胞恶化。受支原体污染的生物制品可引起人类多种疾病，威胁人类健康。支原体污染来源广泛，操作人员与污染细胞来源的支原体污染概率最大。据文献报道，连续培养细胞系中支原体的污染率约为15
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35％，在生物制药行业中约为0.44
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6.70％，95％以上的污染是由以下几种支原体引起：口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、发酵支原体(M.fermentans)、人型支原体(M.hominis)和莱氏无胆甾原体(A.laidlawii)。各国法规和监管部门都明确规定：源于细胞培养的产品都必须确保无支原体污染。
[0003]常见的支原体检测方法包括培养法、指示细胞法、电镜观察法、免疫检测法、生化测定法、核酸扩增技术(NAT)等。目前，各国药典中支原体检测普遍使用的是培养法和指示细胞法。培养法是最经典的支原体分离和检测方法，又称28天培养法，灵敏度可以达到1
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10cfu/mL，劣势在于培养时间长，需要使用多种培养基对不同的支原体种类进行检测，并且对于一些难培养的支原体(比如猪鼻支原体)容易出现漏检的现象。指示细胞法在时间上(3
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5d)比培养法有一定的优势，但灵敏度不及培养法，且只能检测细胞粘附支原体，对于粘附性较差的口腔支原体和精氨酸支原体，则很容易形成假阴性结果，也不适用于能使指示细胞发生病变的病毒样品。不管是培养法还是指示细胞法，都不适用于对时效性要求较高的嵌合抗原受体T细胞等特殊的细胞治疗类产品的快速放行检测。
[0004]NAT法是基于支原体核酸序列(DNA/RNA)的扩增，根据原理分为RT
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PCR，PCR/Nested
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PCR/Touch Down
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PCR、qPCR和恒温扩增法。NAT法因其便捷快速、灵敏度高、特异性好，已被欧洲药典和日本药典所采用，美国药典中也明确说明可以使用经过验证的NAT法或依赖酶活性的方法检测支原体，但要求新方法要与药典方法有可比性。qPCR(荧光定量PCR)主要优势在于可以通过阈值循环数(Ct)值准确评估起始模板量，可以实现高通量和同一个反应孔多通道检测，特异性好，灵敏度高，准确性好，检测种类多，被广泛用于国内外生物制品的质控检测。

技术实现思路

[0005]针对上述现有的支原体检测传统培养法和指示细胞法在生物制品(特别是对时效性要求较高的细胞治疗产品)快速放行检测方面的不足，本专利技术提供了快速广谱检测支原体的引物探针组合、试剂盒及其应用，支原体种类繁多，利用较保守序列设计多对引物探针，可实现同一qPCR反应体系中多种支原体的同时快速检测，为生物制品特别是对时效性要求较高的细胞治疗产品的快速检验放行添油助力。本专利技术提供的引物探针、试剂盒及检测方法，能够在4小时内完成对生物制品中数百种支原体的检测，覆盖度非常广(>132种、>410株支原体)，专属性强(不会与细菌、真菌、人类及动物细胞、常见病毒发生交叉反应)，灵敏度高(核酸检测限0.1
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0.5copies/μl，即1
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5copies/reaction，支原体灵敏度达到10CFU/mL以下)，耐用性强(抗基质干扰能力强、反复冻融不影响体系稳定性)，满足欧洲药典及日本药典支原体NAT法验证指南的要求，能够作为支原体检测传统方法的替代或补充方法。本专利技术具体通过以下技术实现。
[0006]快速广谱检测支原体的引物探针组合，包括10条正向引物，5条反向引物和4条检测探针；10条所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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10所示，5条所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11
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15所示，4条所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.16
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19所示；所述检测探针的5
’
端还偶联有第一荧光标记，3
’
端还偶联有淬灭基团。
[0007]上述核苷酸序列中，兼并碱基W代表碱基A、T，兼并碱基Y代表碱基C、T，兼并碱基S代表碱基G、C，兼并碱基R代表碱基A、G。
[0008]优选地，所述第一荧光标记为FAM、TET、NED、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE或HEX荧光标记；所述淬灭基团为MGB、TAMRA、NFQ、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1或BHQ2淬灭基团。
[0009]更优选地，所述第一荧光标记为FAM荧光标记，所述淬灭基团为MGB淬灭基团。
[0010]本专利技术还提供了上述引物探针组合在制备用于快速广谱检测支原体的产品中的应用。
[0011]本专利技术还提供了一种用于快速广谱检测支原体的试剂盒，包括上述任意一组所述引物探针组合，还包括内控质粒和相应的内控探针，所述内控质粒和内控探针用于监测检测支原体时待测样品中的PCR抑制现象。一般情况下，内控质粒溶于缓冲液中；例如溶解于TE buffer，浓度为300copies/μl。
[0012]优选地，上述试剂盒中，所述内控质粒的目标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述内控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述内控探针的5
’
端偶联有与所述第一荧光标记不同的第二荧光标记，3
’
端偶联有淬灭基团(例如可以选择MGB、TAMRA、NFQ、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1或BHQ2)。
[0013]更优选地，上述试剂盒中，还包括qPCR反应液、阳性对照和PCR级别水。
[0014]更优选地，上述试剂盒中，所述qPCR反应液含有PCR缓冲液、dNTPs、热启动Taq聚合酶和MgCl2；所述阳性对照为含有肺炎支原体和口腔支原体的基因组的缓冲液。
[0015]本专利技术提供的上述定量试剂，所述阳性对照可以通过将肺炎支原体和口腔支原体的基因组用TE buffer配制而成，浓度为100copies/μl。PCR级别水可以选用常规本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.快速广谱检测支原体的引物探针组合，其特征在于，包括10条正向引物，5条反向引物和4条检测探针；10条所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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10所示，5条所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11
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15所示，4条所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.16
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19所示；所述检测探针的5
’
端还偶联有第一荧光标记，3
’
端还偶联有淬灭基团。2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一荧光标记为FAM、TET、NED、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE或HEX荧光标记；所述淬灭基团为MGB、TAMRA、NFQ、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1或BHQ2淬灭基团。3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，所述第一荧光标记为FAM荧光标记，所述淬灭基团为MGB淬灭基团。4.权利要求1
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3任一项所述的引物探针组合在制备用于快速广谱检测支原体的产品中的应用。5.用于快速广谱检测支原体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
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3任一项所述的引物探针组合，还包括内控质粒和相应的内控探针，所述内控质粒和内控探针用于监测检测支原体时待测样品中的PCR抑制现象。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述内控质粒的目标片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述内控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述内控探针的5
’
端偶联有与所述第一荧光标记不同的第二荧光标记，3
’
端偶联有淬灭基团。...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝瑶，罗航，许静，张榜，徐国东，刘愈杰，幸晓莹，王明珍，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：