检测不同鲍特菌的组合物、试剂盒、方法及其用途技术

本发明专利技术属于分子生物学检测领域，具体地，涉及呼吸道感染相关病原菌的检测，更具体地，涉及副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌和支气管败血鲍特菌的检测。本发明专利技术提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌的检测和区分。本发明专利技术的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。检测更为准确。检测更为准确。

【技术实现步骤摘要】
检测不同鲍特菌的组合物、试剂盒、方法及其用途


[0001]本专利技术属于分子生物学检测领域，具体地，涉及呼吸道感染相关病原菌病原体的检测，更具体地，涉及副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌和支气管败血鲍特菌的检测。

技术介绍

[0002]副百日咳鲍特菌是一种革兰氏阴性细菌病原体，在呼吸道中定植并引起百日咳。然而，由副百日咳鲍特菌引起的疾病的严重程度被认为持续时间更短，并且比百日咳杆菌更轻，百日咳杆菌是人类百日咳的主要致病病原体。鲍特氏菌种的比较基因组分析表明，百日咳杆菌和副百日咳鲍特菌是从支气管败血症菌样祖先独立进化而来的。副百日咳鲍特菌分化为两个不同的谱系：一个引起婴儿百日咳，另一个感染绵羊。
[0003]霍氏鲍特菌是一种革兰氏阴性，杆状(或主要是小球虫和短杆状)，生长缓慢的微生物。被认为可引起侵袭性感染(菌血症、脑膜炎、心内膜炎、心包炎、肺炎和关节炎)和百日咳症状。由于百日咳的常规诊断试验不是物种特有的，因此霍氏鲍特菌经常被误认为是百日咳鲍特菌感染。抗菌治疗也可能存在问题，因为霍氏鲍特菌对大环内酯(经验用于治疗百日咳)和第三代头孢菌素(通常用于治疗侵袭性感染)的敏感性低于预期。霍氏鲍特菌对人类的适应仍在继续，毒性可能会增加，因此需要更好的诊断方法和流行病学监测。
[0004]通过生物培养(血液、胸膜或关节培养或鼻咽样本)来培养霍氏鲍特菌是很麻烦的，血液培养阳性的平均培养时间为40h，而且细菌在麦康基琼脂上生长较差。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI
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TOF MS)通过快速和准确地鉴定临床微生物学中获得的大多数病原体，已经彻底改变了细菌的鉴定。对于难以用生化方法准确鉴定的病原体，如霍氏鲍特菌，MALDI
‑
TOF MS是一种理想的鉴定仪器。然而，只有少数已发表的著作报告了霍氏鲍特菌与MALDI
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TOF MS。鉴定的金标准仍然是16S rDNA测序。然而，通过16S测序获得的序列通常与百日咳杆菌获得的序列非常相似，必须进行进一步的序列分析，例如通过PCR检测霍氏鲍特菌特异性基因。
[0005]支气管败血鲍特菌是鲍特菌属中的一种小型革兰氏阴性球杆菌。与挑剔的百日咳杆菌不同，支气管败血鲍特菌在标准细菌培养基上很容易生长。支气管鲍特菌对狗、猫、兔、猪、马和小鼠等动物的呼吸道表现出倾向性。它会导致狗的气管支气管炎或“犬舍咳嗽”，猪萎缩性鼻炎和兔子鼻塞。因为这种倾向性使支气管鲍特菌感染在人类中并不常见，并且因为动物先于大多数人类感染，其被认为是人畜共患病。支气管鲍特菌是一种专性需氧菌，在血液、巧克力和麦康基琼脂等标准实验室培养基上生长1至2天。鉴定是通过生化和表型方法或分子方法进行的，如聚合酶链反应(PCR)、16S rRNA测序和基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI
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TOF)。该病原体可能与百日咳杆菌抗体发生交叉反应，导致百日咳杆菌荧光抗体检测呈假阳性。尽管百日咳杆菌检测长期以来一直被认为是特异性的，但当前PCR检测中使用的靶插入基因序列IS481可能存在于支气管败血鲍特菌菌株中，并引起对错误识别的担忧。
[0006]因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述病原体，并且灵敏度高，特
异性好。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，第一方面，本专利技术提供一种病原体联检并区分的组合物，包括：
[0008]如SEQ ID NO:1～3所示的检测副百日咳鲍特菌的上游引物、下游引物及探针；
[0009]如SEQ ID NO:4～6所示的检测霍氏鲍特菌的上游引物、下游引物及探针；以及
[0010]如SEQ ID NO:7～9所示的检测支气管败血鲍特菌的上游引物、下游引物及探针。
[0011]副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌和支气管败血鲍特菌均被报道能够感染人类，由于三者在遗传上高度相似，常规临床诊断和菌种鉴定的金标准16S rDNA测序均很难进行区分。
[0012]本专利技术提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌的检测和区分。本专利技术的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
[0013]进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
[0014]在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是Rnase P。
[0015]在一些具体的实施方案中，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。
[0016]进一步地，本专利技术组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
[0017]在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO 425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
[0018]在一些具体的实施方案中，副百日咳鲍特菌探针的荧光报告基团为FAM；支气管败血鲍特菌探针的荧光报告基团为HEX(或VIC)；霍氏鲍特菌探针的荧光报告基团为ROX；内标探针的荧光报告基团为CY5。
[0019]进一步地，在一些实施方案中，本专利技术的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本专利技术中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
[0020]本专利技术的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本专利技术中。
[0021]举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。
[0022]在一些具体的实施方案中，本专利技术组合物用于荧光PCR。
[0023]进一步地，探针的3
’
末端还具有非荧光淬灭剂。
[0024]进一步地，探针的3
’
末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
[0025]在一个具体的实施方案中，探针的3
’
末端为BHQ1。
[0026]在一个具体的实施方案中，本专利技术的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
[0027]在一个具体的实施方案中，本专利技术的组合物的各成分存在于同一个包装中。
[0028]进一步地，本专利技术的组合物的各成分以混合的形式存在。
[0029]第二方面，本专利技术提供了上述本专利技术的组合物在制备病原体联检并区分的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为副百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、支气管败血鲍特菌。
[0030]第三方面，本专利技术提供了一种病原体联检并区分的试剂盒，所述试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种病原体联检并区分的组合物，包括：如SEQ ID NO:1～3所示的检测副百日咳鲍特菌的上游引物、下游引物及探针；如SEQ ID NO:4～6所示的检测霍氏鲍特菌的上游引物、下游引物及探针；以及如SEQ ID NO:7～9所示的检测支气管败血鲍特菌的上游引物、下游引物及探针。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，副百日咳鲍特菌的荧光报告基团为FAM；霍氏鲍特菌的荧光报告基团为HEX或IVC；支气管败血鲍特菌的荧光报告基团为ROX；内标探针的荧光报告基团为CY5。5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔同，孙青芝，谭德勇，吴康，戴立忠，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：