LAMP引物组在鉴别哈维氏弧菌中的应用制造技术

本发明专利技术涉及LAMP引物组在鉴别哈维氏弧菌中的应用，属于微生物检测领域。本发明专利技术提供了LAMP引物组在鉴别哈维氏弧菌的应用，所述的LAMP引物组如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
LAMP引物组在鉴别哈维氏弧菌中的应用


[0001]本专利技术属于微生物检测领域，具体地涉及一种LAMP引物组在鉴别哈维氏弧菌中的应用。

技术介绍

[0002]哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)是一种呈弯曲杆状或短杆状的病原菌，通过鞭毛运动，其菌体短小，长度约为0.5
‑
2μm，是一种异养型兼性厌氧菌，具有嗜盐性。由哈维氏弧菌引起的弧菌病已被认为是水产养殖过程中主要的疾病之一，是限制水产养殖行业健康发展的重要因素。哈维氏弧菌感染发病范围广、速度快、发病多集中于春夏季节，以夏季高温期为主。当外界条件适宜，哈维氏弧菌会大量繁殖，通过水产动物自身擦伤或消化道侵入宿主体内，引起宿主组织器官严重病变、坏死，最终导致水产养殖动物死亡。患病水产动物的主要症状表现为游动缓慢且无规律、摄食量下降，身体无法正常保持平衡，体表出现明显红肿，伴有创伤性溃烂，部分个体出现腹水现象。目前针对哈维氏弧菌的传统检测方法包括免疫学方法和普通PCR、实时荧光定量PCR检测方法等，但这类检测方法均存在操作复杂、费时，而且还需借助昂贵的实验仪器，对检测场地、人员素质要求较高等缺陷，不能达到现场和基层实时快速监测病原的目的。
[0003]环介导等温扩增技术(Loop
‑
mediatedisothermalamplificationmethod,LAMP)是一种新兴的核酸扩增方法，依靠BstDNA聚合酶特有的链置换功能和较强的热稳定性和根据靶基因的设计2对引物或者3对引物，可以在30
‑
60min和60
‑
65℃内将极少拷贝数的DNA扩增数百万倍。多引物与靶区域的高符合性、针对性和BstDNA聚合酶的特性使得LAMP有着与qPCR相似的灵敏性和特异性，较PCR方法的灵敏性可高出10
‑
100倍。LAMP反应结果可以通过肉眼直接观察，具有方便、简单、快速、特异性高、无需昂贵的检测仪器、结果判定形象直观等优点，应用前景极为广阔。

技术实现思路

[0004]本专利技术的针对上述技术问题提供一种LAMP引物组在制备鉴别哈维氏弧菌试剂盒中的应用，所述LAMP引物组是基于哈维氏弧菌的Toic基因为特异性靶基因设计，所制备的试剂盒特异性强、操作方便简单、无需昂贵的仪器设备。
[0005]本专利技术利用环介导等温扩增技术，以哈维氏弧菌的Toic基因(GenBank登录号为APP06536.1)为特异靶基因，设计、筛选并优化特异性引物，建立一种LAMP检测方法，并优化反应条件，在反应过程中添加阳性对照组和阴性对照组，并通过钙黄绿素显色法和凝胶电泳分析检测样品组和其他两组对照的扩增产物来判断样品中是否含有哈维氏弧菌，以达到方便简单，经济快速而且灵敏的检测效果，进而实现本专利技术的目的。
[0006]本专利技术是通过如下技术方案来实现的：
[0007]本专利技术的第一个目的是提供LAMP引物组在鉴别哈维氏弧菌的应用，所述的LAMP引物组如SEQ ID NO.1
‑
6所示，所述鉴别为非疾病诊断和治疗目的。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供LAMP引物组在制备鉴别哈维氏弧菌试剂盒中的应用。
[0009]进一步，所述的试剂盒包括环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和所述LAMP引物组。
[0010]所述的阳性对照质控品为含哈维氏弧菌的Toic基因(GenBank登录号为APP06536.1)的质粒DNA，可以通过从哈维氏弧菌的基因组DNA扩增得到。
[0011]所述的阴性对照质控品为超纯水。
[0012]SEQ ID NO.1：前外引物VH
‑
F3：5
’‑
TCCTTCGAGTTTCTCAAGCG
‑3’
；
[0013]SEQ ID NO.2：后外引物VH
‑
B3：5
’‑
TCACGTAGCGATTCGTAGCT
‑3’
；
[0014]SEQ ID NO.3：前内引物VH
‑
FIP：5
’‑
CTAGTTGGCGACCAACCGCTCGC GCACAAGACAACCTAG
‑3’
；
[0015]SEQ ID NO.4：后内引物VH
‑
BIP：5
’‑
TCACTGACGTACACGATGCGCCGAGTTTTCCGCCAAGACT
‑3’
；
[0016]SEQ ID NO.5：前环引物VH
‑
LF：5
’‑
GCTTTTTCTGCACGAACGAA
‑3’
；
[0017]SEQ ID NO.6：后环引物VH
‑
LB：5
’‑
AAGCACAATACGATGCAGTAC
[0018]TTG
‑3’
。
[0019]本专利技术的第三个目的是提供一种非疾病诊断和治疗目的的哈维氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：
[0020](1)对样品进行收集，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA作为LAMP扩增反应的模板；
[0021](2)使用上述的哈维氏弧菌的环介导等温扩增检测引物组，与环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、钙黄绿素显色液及样品基因组DNA混合形成环介导等温扩增反应体系，进行环介导等温扩增反应；
[0022](3)扩增反应结束后，通过钙黄绿素荧光显色法和/或凝胶电泳分析检测样品中是否含有哈维氏弧菌。
[0023]进一步，所述的通过钙黄绿素荧光显色法检测样品中是否含有哈维氏弧菌具体为：若扩增产物颜色为亮绿色，则样品中含有哈维氏弧菌；若扩增产物颜色保持橙黄色不变，则样品中不含有哈维氏弧菌。
[0024]进一步，所述的通过凝胶电泳分析检测样品中是否含有哈维氏弧菌具体为：将扩增产物进行凝胶电泳，若有梯状条带，则样品中含有哈维氏弧菌；若无梯状条带，则样品中不含有哈维氏弧菌。
[0025]优选，所述的环介导等温扩增反应体系总体积25μL，包括10
×
ThermoPol Buffer2.5μL，MgSO4(100mmol/L)1μL，dNTPMix(10mmol/L)4μL，引物VH
‑
FIP、VH
‑
BIP(10μmol/L)各3.5μL，引物VH
‑
F3、VH
‑
B3(10μmol/L)各0.5μL，引物VH
‑
LF、VH
‑
LB(10μmol/L)各2μL，8UBstDNA聚合酶1μL，甜菜碱(100mmol/L)1.5μL、钙黄绿素显色液(5mmol/L，含20mmol/LMnCl2)0.5μL和基因组DNA模板1μL，余量为去离子水。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.LAMP引物组在鉴别哈维氏弧菌的应用，其特征在于，所述的LAMP引物组如SEQ ID NO.1
‑
6所示，所述鉴别为非疾病诊断和治疗目的。2.LAMP引物组在制备鉴别哈维氏弧菌试剂盒中的应用，其特征在于，所述LAMP引物组如SEQ ID NO.1
‑
6所示。3.根据权利要求2所述LAMP引物组在制备鉴别哈维氏弧菌试剂盒中的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括环介导等温扩增反应液、BstDNA聚合酶、钙黄绿素显色液、阳性对照质控品、阴性对照质控品和LAMP引物组，所述LAMP引物组如SEQ ID NO.1
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6所示。4.一种非疾病诊断和治疗目的的哈维氏弧菌的环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)对样品进行收集，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组D...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙云，曹贞洁，周永灿，李涛，吴莹，杜和禾，郭伟良，王世锋，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：