【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，特别涉及牛多瘤病毒三重qpcr检测的引物探针组合及其检测方法。
技术介绍
1、牛多瘤病毒(bovine polyomavirus，bpyv)属于乳多空病毒科(papovaviridae)中的多瘤病毒属(polyomaviridae)，为无包膜闭环双链dna病毒，病毒颗粒40-45nm。根据核苷酸序列不同，bpyv分为3个基因型，分别是bpyv1、bpyv2、bpyv3，其中bpyv2两个亚型，分别是bpyv2a，bpyv2b。
2、bpyv为顽固污染物，广泛存在于牛血清、牛肉产品中，有较强的灭活抗性。商业用途的小牛/胎牛血清多次检出bpyv污染，成年牛血清中也有检出。已有文献表明在mdbk、vero等细胞的培养上清中检测出bpyv的dna，究其缘由是牛血清中存在bpyv污染。研究发现，与牛及牛源制品密切接触人群的血清常检测出bpyv阳性，且有文献报道bpyv可使免疫力低下的新生小鼠致癌。牛血清在细胞培养以及生物制品生产过程中的使用十分普遍，我国现行版《中国药典》三部中“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及质量控制”中明确指出，细胞基质在建立或传代中使用了牛血清，则所建立的mcb/wcb/生产终末细胞应进行牛源病毒检测。《美国药典》也指出使用合适的方法检测用于生产人用生物制品的牛血清中的bpyv。
3、实时荧光定量pcr(taqman探针法)具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优势，被广泛用于病毒检测。因此，研发出一种能够特异性检测bpyv 3个基因型的pcr体系对食品安全以及生物制品
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了牛多瘤病毒三重qpcr检测的引物探针组合及其检测方法，可同时检测bpyv的3个基因型，以满足血清以及使用了血清的相关生物制品的安全性质量控制检测需求。具体通过以下技术实现：
2、本专利技术的第一方面，提供牛多瘤病毒三重qpcr检测的引物探针组合，其包括检测牛多瘤病毒bpyv1、bpyv2a、bpyv2b、bpyv3的引物探针组合，所述bpyv1的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别如seq id no:1-3所示；所述bpyv2a的正向引物和探针的核苷酸序列分别如seq id no:4-5所示；所述bpyv2b的正向引物和探针的核苷酸序列分别如seqid no:6-7所示；所述bpyv2a和bpyv2b的反向引物的核苷酸序列如seq id no：8所示；所述bpyv3的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别如seq id no:9-11所示；
3、所述检测牛多瘤病毒bpyv1、bpyv3的探针的5’端分别偶联有第一荧光基团、第三荧光基团；所述检测牛多瘤病毒bpyv2a和bpyv2b的探针的5’端偶联有第二荧光基团，所述检测牛多瘤病毒bpyv1、bpyv2a、bpyv2b和bpyv3的探针的3’端偶联有淬灭基团；所述第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团为三种不同种类的荧光基团。
4、进一步地，上述第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团为fam、tet、ned、rox、cy3、cy5、vic、joe、hex或texas red荧光基团；所述淬灭基团为tamra、nfq、eclipse、dabcyl、bhq1或bhq2淬灭基团。
5、更进一步地，上述第一荧光基团为hex荧光基团，上述第二荧光基团为texas red荧光基团，上述第三荧光基团为fam荧光基团；上述淬灭基团为bhq1淬灭基团。
6、本专利技术通过对bpyv1、bpyv2(包含bpyv2a、bpyv2b两个亚型)、bpyv3的探针的3’端设计三种不同种类的荧光基团，并结合引物用于三重qpcr反应体系中，能够特异性扩增和区分牛多瘤病毒的具体基因型，以此来判断样本中是否存在bpyv污染并确定bpyv具体的基因型。
7、本专利技术的第二方面，提供一种牛多瘤病毒三重qpcr检测的产品，包括上述的引物探针组合。
8、本专利技术的第三方面，提供上述引物探针组合的应用，制备用于检测牛多瘤病毒的产品。
9、本专利技术的第四方面，提供了一种不以疾病诊断和治疗为目的的牛多瘤病毒的检测方法，采用上述产品进行检测。
10、进一步地，上述检测方法包括步骤：提取待测样品中的核酸；在qpcr仪上创建第一荧光基团检测通道、第二荧光基团检测通道和第三荧光定量基团检测通道，对待测样品的核酸进行三重qpcr反应；根据三重qpcr反应产生的扩增曲线和ct值进行检测结果的判定。
11、更进一步地，上述三重qpcr反应的反应体系为：probe qpcr mix 10μl，检测牛多瘤病毒bpyv1、bpyv3的正向引物、反向引物各0.2ul，检测牛多瘤病毒bpyv2a、bpyv2b的正向引物、反向引物各0.1ul，检测牛多瘤病毒bpyv1、bpyv2a、bpyv2b、bpyv3的探针各0.4ul，待检测模板7.2ul。上述三重qpcr反应的扩增程序为：先25℃10min、95℃30s预变性一次；然后95℃5s，60℃30s，共循环42次。
12、更进一步地，上述检测结果的判定具体为：当所述第一荧光基团检测通道的ct值≤38且有明显扩增曲线，则判定牛多瘤病毒bpyv1阳性；当所述第二荧光基团检测通道的ct值≤38且有明显扩增曲线，则判定牛多瘤病毒bpyv2a或bpyv2b阳性；当所述第三荧光基团检测通道的ct值≤38且有明显扩增曲线，则判定牛多瘤病毒bpyv3阳性；
13、当所述第一荧光基团、第一荧光基团或第三荧光基团检测通道的ct值＞38且有明显扩增曲线，则判定结果无效；
14、当所述第一荧光基团检测通道无ct值且无明显扩增曲线，则判定牛多瘤病毒bpyv1阴性；当所述第二荧光基团检测通道无ct值且无明显扩增曲线，则判定牛多瘤病毒bpyv2a和bpyv2b阴性；当所述第三荧光基团检测通道无ct值且无明显扩增曲线，则判定牛多瘤病毒bpyv3阴性。
15、与现有技术相比，本专利技术的有益之处在于：
16、1.目前已有的bpyv qpcr检测方法经比对均只能检测到bpyv1，本专利技术提供的牛多瘤病毒三重qpcr检测的引物探针组合能够覆盖3种基因型，与现有技术相比，覆盖范围更广。
17、2.利用本专利技术提供的引物探针组合进行三重qpcr，根据ct值和扩增曲线能够快速判断出样本中是否存在bpyv污染并确定bpyv具体的基因型，能够一次检测多个靶基因，加快了检测进程，检测效率高。
18、3.本专利技术的bpyv三重qpcr反应体系专属性强，其引物探针组合与人和动物细胞、非bpyv牛源病毒基因组均无交叉反应。
19、4.本专利技术的bpyv三重qpcr反应体系灵敏度高，检测限均可达100copies/reaction。
20、5.本专利技术的bpyv三重qpcr反应体系耐用性及抗基质干扰能力强，检测限的bpyv引入293/ch本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.牛多瘤病毒三重qPCR检测的引物探针组合，其特征在于，包括检测牛多瘤病毒BPyV1、BPyV2a、BPyV2b、BPyV3的引物探针组合，所述BPyV1的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-3所示；所述BPyV2a的正向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4-5所示；所述BPyV2b的正向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:6-7所示；所述BPyV2a和BPyV2b的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；所述BPyV3的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9-11所示；
2.根据权利要求1所述的牛多瘤病毒三重qPCR检测的引物探针组合，其特征在于，所述第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团为FAM、TET、NED、ROX、CY3、CY5、VIC、JOE、HEX或Texas Red荧光基团；所述淬灭基团为TAMRA、NFQ、ECLIPSE、DABCYL、BHQ1或BHQ2淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的牛多瘤病毒三重qPCR检测的引物探针组合，其特征在于，所
4.一种牛多瘤病毒三重qPCR检测的产品，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物探针组合。
5.权利要求1-3任一项所述的引物探针组合的应用，其特征在于，制备用于检测牛多瘤病毒的产品。
6.一种不以疾病诊断和治疗为目的的牛多瘤病毒的检测方法，其特征在于，采用权利要求4所述的产品进行检测。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，包括步骤：提取待测样品中的核酸；在qPCR仪上创建第一荧光基团检测通道、第二荧光基团检测通道和第三荧光定量基团检测通道，对待测样品的核酸进行三重qPCR反应；根据三重qPCR反应产生的扩增曲线和Ct值进行检测结果的判定。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述三重qPCR反应的反应体系为：Probe qPCR MIX 10μL，检测牛多瘤病毒BPyV1、BPyV3的正向引物、反向引物各0.2uL，检测牛多瘤病毒BPyV2a、BPyV2b的正向引物、反向引物各0.1uL，检测牛多瘤病毒BPyV1、BPyV2a、BPyV2b、BPyV3的探针各0.4uL，待检测模板7.2uL。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述三重qPCR反应的扩增程序为：先25℃10min、95℃30s预变性一次；然后95℃5s，60℃30s，共循环42次。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测结果的判定具体为：当所述第一荧光基团检测通道的Ct值≤38且有明显扩增曲线，则判定牛多瘤病毒BPyV1阳性；当所述第二荧光基团检测通道的Ct值≤38且有明显扩增曲线，则判定牛多瘤病毒BPyV2a或BPyV2b阳性；当所述第三荧光基团检测通道的Ct值≤38且有明显扩增曲线，则判定牛多瘤病毒BPyV3阳性；
...【技术特征摘要】
1.牛多瘤病毒三重qpcr检测的引物探针组合，其特征在于，包括检测牛多瘤病毒bpyv1、bpyv2a、bpyv2b、bpyv3的引物探针组合，所述bpyv1的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别如seq id no:1-3所示；所述bpyv2a的正向引物和探针的核苷酸序列分别如seq id no:4-5所示；所述bpyv2b的正向引物和探针的核苷酸序列分别如seq id no:6-7所示；所述bpyv2a和bpyv2b的反向引物的核苷酸序列如seq id no:8所示；所述bpyv3的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列分别如seq id no:9-11所示；
2.根据权利要求1所述的牛多瘤病毒三重qpcr检测的引物探针组合，其特征在于，所述第一荧光基团、第二荧光基团、第三荧光基团为fam、tet、ned、rox、cy3、cy5、vic、joe、hex或texas red荧光基团；所述淬灭基团为tamra、nfq、eclipse、dabcyl、bhq1或bhq2淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的牛多瘤病毒三重qpcr检测的引物探针组合，其特征在于，所述第一荧光基团为hex荧光基团，所述第二荧光基团为texas red荧光基团，所述第三荧光基团为fam荧光基团；所述淬灭基团为bhq1淬灭基团。
4.一种牛多瘤病毒三重qpcr检测的产品，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物探针组合。
5.权利要求1-3任一项所述的引物探针组合的应用，其特征在于，制备用于检测牛多瘤病...
【专利技术属性】
技术研发人员：王明珍，赵巍薇，罗祥，陈美琳，郝瑶，刘愈杰，徐国东，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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